(三)DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)：
1.解鏈酶(helicase)
DNA開始復(fù)制時(shí)首先在起始點(diǎn)處解開雙鏈，反應(yīng)是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進(jìn)行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動(dòng)，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動(dòng)。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。
2.單鏈結(jié)合蛋白：(single strand binding proteins,SSBP)
它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會(huì)再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時(shí)的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用(圖16－8)。
圖16-8 大腸桿菌DNA復(fù)制叉中復(fù)制過程簡(jiǎn)圖
3.引發(fā)體的形成：
DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對(duì)簡(jiǎn)單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B. Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。
(1)引物酶(primase)
它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等，它們?cè)贒NA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個(gè)磷酸二酯鍵的位置。
(2)引發(fā)體(primosome)
高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。
三、DNA復(fù)制的延長(zhǎng)階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子：
DNA的復(fù)制實(shí)際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧單核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,簡(jiǎn)寫為dNTP)聚合成DNA的過程。
這是一個(gè)非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多種酶和蛋白質(zhì)參與，現(xiàn)分別敘述它們?cè)贒NA復(fù)制中作用。
(一)DNA的聚合反應(yīng)和DNA聚合酶
圖16－9 DNA聚合酶的作用
1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ，(DNa polymerase Ⅰ,簡(jiǎn)寫DNA polⅠ)后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ，Ⅲ，簡(jiǎn)寫DNA polⅡ,DNA polⅢ)實(shí)驗(yàn)證明大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過程靠DNa polⅢ起作用，而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA錯(cuò)配的校正和修復(fù)中起作用。見表16－1。
這種酶的共同性質(zhì)是：①需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶(DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要RNA或DNA做為引物(primer)，即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′桹H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。圖16-9。④三種DNA聚合酶都屬于多功能酶，它們?cè)贒NA復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)，所以我們著重介紹DNa polⅠ的作用并指出另外二種DNA pol的特殊性：
