信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前分子免疫學(xué)中研究的熱點(diǎn)。免疫學(xué)中所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要包括淋巴細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其研究手段多種多樣,包括細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及蛋白質(zhì)化學(xué)等技術(shù)。本節(jié)將扼要介紹目前信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中常用的方法和技術(shù)。
一、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的鑒定
在淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)地過程中可發(fā)生多種蛋白底物的磷酸化,包括酪氨酸磷酸化、蘇氨酸殘基磷酸化及絲氨酸殘基磷酸化。它們分別由不同的蛋白激酶所催化。這些磷酸化蛋白通常都為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,在信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要的作用。一些信號(hào)蛋白結(jié)構(gòu)中含SH-2結(jié)構(gòu)域可同某些磷酸化的酪氨酸殘基相結(jié)合,使信號(hào)得以逐級(jí)傳遞。含酪氨酸磷酸化的蛋白鑒定通常是首先分離粗提蛋白,采用針對(duì)含這些氨基酸殘基磷酸化蛋白的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀�。╥mmunoprecipitation),SDS-PAGE電泳,然而采用Western blotting及immunoblotting鑒定其分子量,進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆信號(hào)蛋白,搞清其基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。
二、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中第二信使含量的測定
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,第二信使(second messenger)含量的高低同信號(hào)傳遞密切相關(guān)。目前測定的第二信使主要包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+([Ca2+]i)、二酰基甘油(DAG)、三磷酸肌醇(IP3)以及環(huán)腺苷酸(cAMP)等。
1.[Ca2+]i的測定 細(xì)胞內(nèi)Ca2+的測定方法有原子吸收光譜法、離子微電極測定法、放射示蹤法及標(biāo)記示蹤法等。目前常用標(biāo)記示蹤法,即用熒光探針標(biāo)記靶細(xì)胞。常用的熒光探針有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1較為敏感。
2.IP3的測定 采用3H-TdR標(biāo)記的肌醇標(biāo)記靶細(xì)胞后,用不同的刺激劑刺激細(xì)胞,分離磷脂酰肌醇混合物,通過陰離子交換層析柱(Serva公司Dowex1*8)分離洗脫,收集IP3洗脫峰后進(jìn)行液閃測定。此外,還可以使用Amersham公司生產(chǎn)的D-myo-IP3[3H]分析系統(tǒng)直接測定粗提物中的IP3含量,此方法簡易、敏感。
3.DAG的測定 首先提取含DAG的樣品,然后采用Amersham公司生產(chǎn)的DAG分析系統(tǒng)進(jìn)行測定。此系統(tǒng)測定的原理是用DAG激酶催化底物DAG,使之發(fā)生磷酸化,外源加入32γ-ATP,最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離后測定放射性含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出樣品中DAG的含量。
4.cAMP的測定 可選擇不同的方法:(1)cAMP[3H]分析系統(tǒng),其優(yōu)點(diǎn)是放射性半衰期長,可用于大量樣品的分析;(2)cAMP[125I]分析系統(tǒng),用于小量樣品的分析;(3)cAMp ILISA測定方法,此方法簡便、敏感。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
三、激酶活性的測定
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中往往涉及多種激酶的活化,因而對(duì)這些激酶活性的測定可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的一種重要指標(biāo)。常見激酶活性的測定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的試劑盒。檢測原理是根據(jù)激酶可以催化特定底物發(fā)生磷酸化,外源加入32γ-ATP,通過分離反應(yīng)產(chǎn)物后測定放射活性,從標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品酶的活性。前已提及,PKC從胞質(zhì)向胞膜的轉(zhuǎn)位是PKC活化的一個(gè)重要指標(biāo),因而分離胞質(zhì)和胞膜中的PKC并分別測定其活性,計(jì)算胞膜上PKC活性占總PKC活性的比例,從而判定PKC的活化程度。
四、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的分離和鑒定
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果是細(xì)胞核內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子同DNA上某些特定的序列結(jié)合,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性和基因的表達(dá)水平。因而分離鑒定細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中具有獨(dú)特的意義。根據(jù)核轉(zhuǎn)錄因子可與一些特定的核甘酸序列結(jié)合的特點(diǎn),將其特定的核苷序列標(biāo)記上同位素,來鑒定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核轉(zhuǎn)錄因子。核轉(zhuǎn)錄因子具有一些特征性的結(jié)構(gòu)域,即亮氨酸拉鏈(lucine zipper)、鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger)和螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix)結(jié)構(gòu)。并且受用足跡法(foot printing)分析新發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的位置和核甘酸序列。
隨著分子生物學(xué)核技術(shù)的發(fā)展,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究取得很大進(jìn)展。采用基因克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了越來越多的信號(hào)蛋白分子;嵌合分子的構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)的應(yīng)用為細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供了有效的手段;點(diǎn)突變、肽競爭等技術(shù)使信號(hào)蛋白中某些功能區(qū)的作用的研究變得更為精確。