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醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)二十五 核酸探針和分子雜交技術(shù)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué):實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)二十五 核酸探針和分子雜交技術(shù):實(shí)驗(yàn)二十五 核酸探針和分子雜交技術(shù)一、分子雜交技術(shù)的基本原理分子雜交技術(shù)是根據(jù)兩條單鏈DNA中互補(bǔ)堿基序列能專一配對的原理進(jìn)行的。若兩個退火的單鏈來源不同(如一個同位素標(biāo)記的探針DNA加入源于臨床標(biāo)本的DNA中),這一反應(yīng)通常稱為雜交。所謂探針是指用某種方法標(biāo)記的DNA或RNA片段,它能用于測定標(biāo)本中是否存在與之互補(bǔ)的DNA或RNA序列。目前實(shí)驗(yàn)室常用的核酸雜交方法包括:Southern印跡法、N

實(shí)驗(yàn)二十五  核酸探針和分子雜交技術(shù)

一、分子雜交技術(shù)的基本原理

分子雜交技術(shù)是根據(jù)兩條單鏈DNA中互補(bǔ)堿基序列能專一配對的原理進(jìn)行的。若兩個退火的單鏈來源不同(如一個同位素標(biāo)記的探針DNA加入源于臨床標(biāo)本的DNA中),這一反應(yīng)通常稱為雜交。所謂探針是指用某種方法標(biāo)記的DNA或RNA片段,它能用于測定標(biāo)本中是否存在與之互補(bǔ)的DNA或RNA序列。目前實(shí)驗(yàn)室常用的核酸雜交方法包括:Southern印跡法、Northern印跡法、斑點(diǎn)雜交法、原位雜交法等。

1.Southern印跡法(Southernblot)  將待測DNA用限制性內(nèi)切酶切割后,其片段在瓊脂糖凝膠電泳中按分子量大小分離,隨后使DNA在原位發(fā)生變性,并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上,再用標(biāo)記的探針與固著于濾膜上的DNA雜交,最后根據(jù)探針的標(biāo)記方法不同而采用不同的檢測方法,確定與探針互補(bǔ)的電泳條帶的位置。由于DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割,故不僅可檢出雜交片段的數(shù)量和大小,而且可在一定程度上反映待測DNA的基因組成。

2.Northern印跡法(Northernblot)  與Southern印跡法相似,只不過待測核酸為RNA,由于RNA只有被有效轉(zhuǎn)錄才能在Nort中國衛(wèi)生人才網(wǎng)hern雜交中顯示出來,所以此法可作為研究特定基因表達(dá)的手段。

3.斑點(diǎn)雜交法(dotblot)  將待測的DNA標(biāo)本直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)變性處理后用探針進(jìn)行雜交。這種方法省去內(nèi)切酶消化、電泳、轉(zhuǎn)移等步驟,是一種快速、方便的優(yōu)點(diǎn)。

4.原位雜交法(insitu hybridization)  為核酸雜交技術(shù)與細(xì)胞學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種特殊檢測方法。它在不破壞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的情況下,用標(biāo)記的探針直接檢測切片標(biāo)本中的核酸。此法不需從細(xì)胞中提取核酸,可直接了解細(xì)胞內(nèi)基因的定位及分布情況,最適宜外科活檢標(biāo)本、病理切片標(biāo)本等,不但能確定有無微生物序列的存在,還可清楚地了解到哪些細(xì)胞受到影響。

二、核酸探針的類型及標(biāo)記方法

1.探針的類型  任何形式的核酸(DNA、RNA)經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記后均可作為探針用于雜交,根據(jù)核酸的性質(zhì)可將探針分為以下幾類:

(1) 全染色體探針  這類探針制備簡便,主要用于細(xì)菌的檢測,但特異性不如克隆片段探針。

(2) 克隆片段DNA  這是目前使用最多的探針類型,由于克隆片段的特異性可以選擇,因而它具有更大的靈活性,而且便于進(jìn)一步分析DNA結(jié)構(gòu)及發(fā)展新的檢測技術(shù),如PCR技術(shù)。

(3) RNA及其cDNA探針  RNA探針具有與DNA雜交親和力強(qiáng)、不會發(fā)生自身雜交、

未雜交探針易于去除等優(yōu)點(diǎn),但探針制備較為費(fèi)時,產(chǎn)量較低,且易被RNase降解。其cDNA探針則穩(wěn)定性較好,可用多種方法標(biāo)記,并且產(chǎn)量較高。

(4) rDNA(rRNA基因)探針  rDNA,即rRNA基因。rRNA是核蛋白體的主要成分,胞內(nèi)含量豐富。不同菌種其rDNA的核甘酸序列不同,且在進(jìn)化上十分保守,故可用特異的rDNA探針檢測相應(yīng)rRNA靶序列來確定細(xì)菌的種類。

(5) 寡核苷酸探針  為人工合成的短鏈核苷酸,特異性高,可檢出點(diǎn)突變。因其短小、易穿入組織,可用于原位雜交,但同時也由于核苷酸序列短,樣品中與之相似的序列較多,造成雜交背景提高或出現(xiàn)假陽性。

2.探針的標(biāo)記方法  分放射性標(biāo)記與非放射性記兩大類。放射性同位素標(biāo)記的探針敏感性高,分辨力強(qiáng),但成本高,操作煩瑣、費(fèi)時,對操作人員危險(xiǎn)性大,廢棄物難以處理,而且很多同位素半衰期很短,也限制了其標(biāo)記的探針的壽命。非放射性標(biāo)記是在核酸鏈上共價(jià)連接半抗原、生物素或熒光素等化學(xué)基團(tuán),雜交后通過酶底物顯色或熒光計(jì)檢測。非放射性標(biāo)記探針具有使用周期長,檢測程序簡單,節(jié)省費(fèi)用,對操作人員健康無威脅等優(yōu)點(diǎn),有些探針的靈敏度已達(dá)到或接近放射性同位素標(biāo)記的探針。目前生物素或地高辛標(biāo)記的探針越來越受到普遍的歡迎。

三、操作過程

血清標(biāo)本點(diǎn)樣

執(zhí)業(yè)獸醫(yī)【材料】

1.0.45μm孔徑硝酸纖維素膜(國產(chǎn)可用混合纖維素酯微孔濾膜)。

2.加樣器、抽濾板。

3.試劑  溶液I:1mol/LNaOH;溶液Ⅱ:0.6mol/LTris·HCl(pH7.4);溶液Ⅲ:pH7.4,3.0mo1/LNaCl;0.5mol/L Tris·HCl;溶液Ⅳ:2xSSC(0.3mol/LNaCl,0.3mol/L枸櫞酸鈉)。

【方法】

1.取上述濾膜用溶液Ⅳ浸透,置抽濾板上,按水泵減壓法緩慢抽濾。

2.將膜置液I上變性,30min后,用溶液Ⅱ、Ⅲ分別中和,80℃干烤2h以固定核酸(此時為單鏈)。

探針制備

【材料】

1.缺口翻譯(NickTranslation)試劑:緩沖液、dNTP混合物(如同位素標(biāo)記者為32P-dATP,則加入dCTP,dGTP及dTTP)、同位素標(biāo)記dNTP(加dATP)、DNA酶I、DNA多聚酶I。

2.SephadexG50柱、閃爍計(jì)數(shù)器、待標(biāo)記病毒DNA。

【方法】

1.取lμg待標(biāo)記病毒DNA,加入同位素標(biāo)記的dNTP,補(bǔ)充未標(biāo)記的其他dNTP,加入DNA酶I(打開DNA鏈上缺口)及DNA多聚酶I(同時將各dNTP進(jìn)行聚合,以一條鏈為模板,聚合另一條相應(yīng)互補(bǔ)鏈),從而使病毒DNA標(biāo)上同位素。14℃水浴2h使反應(yīng)完成。

2.加入終止反應(yīng)液后,上SephadesG50(葡聚糖柱),以分離聚合的DNA鏈與游離的小分子dNTP。第一峰為標(biāo)記探針,后峰為游離dNTP。

3.用閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)算標(biāo)記的cpm數(shù)。

預(yù)雜交及雜交

【材料】

1.厚塑料紙,封口機(jī)。

2.預(yù)雜交液:甲酰胺SSC,Deinhardt液、低分子量DNA、緩沖液。

3.雜交液:預(yù)雜交液、硫酸葡聚糖及煮沸后迅速冷卻的探針DNA(使成單鏈)。

【方法】

1.在三面封口的塑料袋中加入已制備好的有樣品的濾膜。加入預(yù)雜交液,趕去氣泡。封口后,42℃水浴振搖以預(yù)雜交6~4h。

2.棄去預(yù)雜交液,加入雜交液,封口后,42℃振搖雜交24~6h。

3.倒去雜交液,用高鹽、低鹽洗液洗滌濾膜。

4.包X光片,置-70℃曝光。經(jīng)一時間后,取出X光片定影、顯影。

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