綜合性實驗四流行性感冒病毒血凝抑制試驗
病毒性感染的正確診斷有助于臨床確診、合理治療以及為控制流行制定有效的措施。診斷所
用方法包括病毒的分離鑒定、形態(tài)學(xué)檢查、血清學(xué)試驗和核酸檢測。標(biāo)本的采集原則和要求
是：(1
)早期采集；(2)由感染部位采集；(3)注意無菌操作，對易受污染的標(biāo)本應(yīng)使用抗生素；(4)
標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢；(5)血清學(xué)試驗應(yīng)采集患者急性期與恢復(fù)期雙份血清。
病毒的分離培養(yǎng)是病毒生物學(xué)特性研究、疫苗制備、臨床診斷和藥物選擇等方面非常重要的
技術(shù)方法。由于病毒為細(xì)胞內(nèi)專性寄生，所以必須以活細(xì)胞為病毒的培養(yǎng)環(huán)境。根據(jù)不同病
毒的特性，培養(yǎng)方法可選擇細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法和動物接種法。
細(xì)胞培養(yǎng)法是將離體分散的活細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)液，在適當(dāng)溫度、氣體條件
下培養(yǎng)，細(xì)胞生長到一定程度時接種病毒，病毒增殖后可使細(xì)胞出現(xiàn)病變，以此來分離和鑒
定病毒。
雞胚培養(yǎng)法是病毒培養(yǎng)的常用方法之一，在痘類病毒、粘液病毒和皰疹病毒的研究中占重要
地位，主要是因為雞胚的組織分化程度低，雞胚來源充足，操作簡單，對接種的病毒不產(chǎn)生
抗體。
動物接種主要用于病毒的分離、鑒定、制造疫苗和免疫診斷血清等，途徑有腦內(nèi)接種、腹腔
內(nèi)接種、皮下和皮內(nèi)接種及鼻腔內(nèi)接種。
病毒血清學(xué)試驗是診斷病毒感染和研究病毒的重要手段。其基本原理和細(xì)菌血清
學(xué)反應(yīng)相同，可用已知抗原檢測病人的未知抗體，也可用已知抗體檢測未知抗原。由于病毒
隱性感染普遍存在，所以在檢測病人抗體時，必須取患者急性期血清和恢復(fù)期血清(雙份血
清)進(jìn)行對比試驗，若第二次血清抗體效價比第一次高出4倍以上時，才有診斷意義。常用的
血清學(xué)試驗有：中和試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、血凝和血凝抑制試驗、免疫熒光技術(shù)、酶免疫組
化法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、固相放射免疫測定等。
一流感病毒的雞胚培養(yǎng)法
【實驗?zāi)康摹?/p>
熟悉雞胚培養(yǎng)法及用途。
【實驗原理】
雞胚接種法為常用病毒培養(yǎng)法之一，操作簡便，來源容易。雞胚接種法分為(1)絨毛尿囊膜
接
種法，主要用于牛痘病毒、單純皰疹病毒的培養(yǎng)；(2)羊膜腔接種法，主要用于從臨床標(biāo)本
分離病毒；(3)尿囊腔接種法，主要用于流感病毒、新城雞瘟病毒、腮腺炎病毒的培養(yǎng)和傳
代；(4)卵黃囊接種法，主要用于立克次體和鸚鵡熱衣原體的分離與培養(yǎng)。
流感病毒的原代分離一般采用雞胚的羊膜腔接種，而次代以后傳代或制備流感疫苗時可采用
尿囊腔接種。
【實驗內(nèi)容與方法】
一觀察雞胚胎模型
【材料】
10日齡雞胚
【方法】
取孵育10日齡雞胚，照視觀察是否存活：(1)血管是否清晰；(2)胚胎是否活動，觀察小雞的
眼睛黑點是否移動；(3)蛋的一邊(較亮)和胎盤一邊(暗紅色)是否界限分明，如果胎盤一邊
變黑或變蒼白都表示已死去。標(biāo)出氣室及胚胎位置。注意絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵
黃囊的位置。
二尿囊腔接種法
【材料】
流感病毒(疫苗)液10日齡雞胚注射器12號針頭小鉆眼科鑷子碘酒和酒精棉球
無菌毛細(xì)管無菌試管
圖11雞胚尿囊腔接種法
【方法】
1避開雞胚血管，在離氣室邊緣上0.5cm處作一標(biāo)記，定為注射口。用碘酒和酒精在注射
口和氣室處消毒，并在注射口鉆一小孔。
2用無菌的注射器吸取0.1～0.2ml已稀釋的流感病毒液，由小孔垂直插入，向雞胚方向深
入1cm左右，不能傷及雞胚，注入流感病毒液。
3石臘溶化封口，置37℃溫箱中，每日翻動二次，照檢一次。24
小
時內(nèi)死亡者棄去。48～72小時后移入4℃冰箱6小時或過夜(如急需收獲病毒液可放—20℃30
～60分
鐘)，將雞胚凍死使血液凝固，以免收獲時血管破裂出血影響效價。注意雞胚直立，令氣室
向上。
4收獲尿囊液之前，取出雞胚用酒精消毒氣室端，用鑷子擊破氣室卵殼，沿氣室邊緣用鑷
子撕去孵膜，在絨毛膜無大血管處穿破，用無菌毛細(xì)管吸取尿囊液，一般可得4～6ml。
二流感病毒血球凝集試驗
【實驗?zāi)康摹?/p>
了解流感病毒血凝試驗的原理、方法和結(jié)果分析。
【實驗原理】
病毒能在尿囊的內(nèi)胚層細(xì)胞繁殖，繁殖的病毒被釋放到尿囊液中，因此尿囊液中含有大量的
病毒，可用血凝試驗來測定病毒的存在。
流感病毒顆粒具有兩種抗原，即可溶性抗原和血凝抗原。可溶性抗原是同一型中各亞型病毒
所共有的，而血凝抗原是各亞型所特有的。因此，利用可溶性抗原作補(bǔ)體結(jié)合試驗可確定病
毒的型別，用血凝抑制試驗可鑒定病毒的亞型。
血凝素(HA)是流感病毒表面的一種糖蛋白，能與人及一些哺乳動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，
這不屬抗原—抗體的特異性凝集，而是由于病毒的HA與紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體結(jié)合所致。
血凝試驗可用來測試病毒體的存在，也可用于病毒的鑒定。
【實驗內(nèi)容與方法】
一流感病毒血球凝集試驗
【材料】
流感病毒雞胚尿囊液抗流感病毒免疫血清0.5%雞紅血球懸液生理鹽水小試管1毫
升吸管
【方法】
1.取小試管9支排于試管架上，按下表進(jìn)行試驗，每支各加入生理鹽水0.5毫升。
2.第一管加入病毒(1∶5)0.5毫升即成1∶10，混勻后吸出0.5毫升放入第二管，如此依次稀
釋至8管，自第8管吸出0.5毫升連同吸管一并放入消毒缸內(nèi)。第九管不加病毒，為紅細(xì)胞對
照管。
3.每管加入0.5%雞紅血球懸液0.5毫升，搖勻后放室溫22～24℃45分鐘(或冰箱0～4℃中2小
時)觀察結(jié)果并記錄。
病毒血凝試驗試管號加樣〖〗1
〖〗2〖〗
3〖〗4〖〗5〖〗6〖〗7〖〗8〖〗9
生理鹽水(ml)〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5
病毒液(ml)〖〗0.5〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—
病毒稀釋度〖〗1∶10〖〗1∶20〖〗1∶40〖〗1∶80〖〗1∶160〖〗1∶320〖〗1∶640〖〗
1∶1280〖〗—
雞紅細(xì)胞液(ml)〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5
搖勻，置室溫45分鐘。
三流感病毒血凝抑制試驗
【實驗?zāi)康摹?/p>
了解流感病毒血液疑抑制試驗的原理方法的結(jié)果分析。
【實驗原理】
流感病毒血凝素如果首先遇到相應(yīng)的抗體
，則被抗體中和而失去凝集作用，據(jù)此原理建立的血凝抑制試驗可用已知抗體鑒定未知病毒
，或用已知的病毒抗原來測定病人血清中的相應(yīng)抗體。
【實驗內(nèi)容與方法】
1取小試管10支排于試管架上，于第一至第七管中各加入生理鹽水0.25ml，第十管加
入生理鹽水0.5ml。
2第一管加入血清(1∶5)0.25ml，混勻后吸出0.25ml放入第二管，如此依次稀釋至第七
管
，自第七管吸出0.25ml連同吸管一并放入消毒缸內(nèi)。第八管加1∶5血清0.25ml，為血清對照
管。第九管不加血清，為抗原對照管。第十管不加血清，為紅細(xì)胞對照管。
3除第八和第十管外，其余各管加入0.25ml含4個單位的病毒抗原�？乖瓎挝灰匝囼炛�
的凝集情況確定，如血凝試驗的血凝效價為1∶320醫(yī)學(xué)全.在線
，為1個血凝單位，0.25ml中含4個單位即1∶80。
4搖勻后，置室溫10分鐘，每管加入0.5%雞經(jīng)血球懸液0.25ml(從第一至七管，血清的最終
稀釋度分別為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280)，搖勻后放室溫
45分鐘(或冰箱4℃2小時)，觀察結(jié)果并記錄。
【結(jié)果分析】
(一)血凝試驗
切勿將試管振搖，應(yīng)輕輕拿起觀察管底。
先觀察對照管。
根據(jù)不同的血清稀釋濃度，各管中出現(xiàn)不同的紅細(xì)胞凝集，具體記錄如醫(yī)學(xué)全.在線bhskgw.cn下：
-：無紅細(xì)胞凝集，紅細(xì)胞在管底形成一個小團(tuán)，邊緣光滑整齊。
+：紅細(xì)胞在管底形成一個小團(tuán)，但邊緣不光滑，四周有小凝集塊。
：紅細(xì)胞在管底形成一個環(huán)狀小團(tuán)，四周有小凝集塊。
：紅細(xì)胞呈薄層，均勻鋪在管底，但邊緣不整齊，有下沉趨向。
：紅細(xì)胞呈較厚層，均勻鋪在管底，無紅細(xì)胞沉積。
血凝效價：以出現(xiàn)“++”凝集的最高病毒液稀釋度作為血凝效價，即含一個
血凝單位，如第5管1∶160，則該病毒懸液含1個血凝單位。
(二)血凝抑制試驗
先觀察對照管。
如抗原對照管出現(xiàn)完全凝集，血清對照管和紅細(xì)胞對照管不發(fā)生凝集，再觀
察試驗管，判斷效價。一般以能完全抑制病毒抗原發(fā)生紅細(xì)胞凝集的血清最高稀釋度即為該
血清的血凝抑制效價。
比較早期、恢復(fù)期血清的血凝抑制抗體的效價，并作出判斷。
【思考題】
①如血凝抑制試驗抑制到第5管，則血凝抑制效價為多少?
②血凝抑制試驗設(shè)立了哪些對照管?為什么要設(shè)立這些對照?
(龍北國張文炳羅軍)
