醫(yī)用化學(xué)-電子教材:第八章 比色分析法

第八章比色分析法

第一節(jié) 比色分析法的基本原理

   比色分析法（colorimetry analysis)是基于溶液對(duì)光的選擇性吸收而建立起來(lái)的一種分析方法，又稱為吸光光度法。

　　有色物質(zhì)溶液的顏色深度與其濃度有關(guān)。有色物質(zhì)溶液的濃度和液層的厚度越大，顏色越深。利用光學(xué)方法比較溶液顏色的深淺，可以測(cè)定溶液的濃度。

　　比色分析法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于微量組分的測(cè)定。通�？蓽y(cè)定含量在10^-1~10^-4mg·L^－1 的痕量組分。比色分析法如同其它分析一樣，也具有相對(duì)誤差較大（一般為1%~5%)的缺點(diǎn)。但對(duì)于微量組分的測(cè)定來(lái)說(shuō)，由于絕對(duì)誤差很小，測(cè)定結(jié)果也是令人滿意的。在醫(yī)學(xué)學(xué)科中，比色分析法被廣泛應(yīng)用于藥物分析、衛(wèi)生分析、生bhskgw.cn/pharm/化分析等方面。

　　一、物質(zhì)的顏色和光的關(guān)系

光是一種電磁波。自然光是由不同波長(zhǎng)（400~760nm)的電磁波按一定比例組成的混合光，通過(guò)棱鏡可分解成紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等各種顏色相連續(xù)的可見(jiàn)光譜。如把兩種光以適當(dāng)比例混合而產(chǎn)生白光時(shí)，這兩種光的顏色互為補(bǔ)色，如圖8-1所示，直線兩端顏色的光互為補(bǔ)色。

圖8-1   光的互補(bǔ)色示意圖

　　當(dāng)白光通過(guò)溶液時(shí)，如果溶液對(duì)各種波長(zhǎng)的光都不吸收，溶液就沒(méi)有顏色。如果溶液吸收了一部分波長(zhǎng)的光，則溶液呈現(xiàn)透過(guò)溶液后剩余部分光的顏色。例如，我們看到KMnO₄溶液在白光下呈紫紅色，就是因?yàn)榘坠馔高^(guò)溶液時(shí)，綠色光大部分被吸收，而其它各色的光都能透過(guò)。在透過(guò)的光中除紫紅色外都能兩兩互補(bǔ)成白色，所以KMnO₄溶液呈紫紅色。

表8-1  溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系

　　同理，CuSO₄溶液能吸收黃色光，所以溶液呈藍(lán)色。由此可見(jiàn)，有色溶液的顏色是被吸收光顏色的補(bǔ)色。吸收越多，補(bǔ)色的顏色越深。比較溶液顏色的深淺，實(shí)質(zhì)上就是比較溶液對(duì)它所吸收光的吸收程度。表8-1列出了溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系。

　　二、朗伯－比爾（Lambert--Beer)定律

當(dāng)一束平行單色光（只有一種波長(zhǎng)的光)照射有色溶液時(shí)，光的一部分被吸收，一部分透過(guò)溶液（見(jiàn)圖8-2)。設(shè)入射光的強(qiáng)度為I₀。溶液的濃度為c，液層的厚度為b，透射光強(qiáng)度為I，則

   圖8-2  光吸收示意圖

   Kbc  (8-1)

　　上式中表示光線透過(guò)溶液時(shí)被吸收的程度，稱為吸光度（absorbance，A)或消光度（opticaldentsity，O.D.)。因此，上式又可寫為：

   A = Kbc(8-2)

　　上式為朗伯－比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式。它表示一束單色光通過(guò)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

　　式(8-2)中K為吸光系數(shù)， 當(dāng)溶液濃度c和液層厚度b的數(shù)值均為1時(shí)，A＝K，即吸光系數(shù)在數(shù)值上等于 c 和 b 均為1時(shí)溶液的吸光度。對(duì)于同一物質(zhì)和一定波長(zhǎng)的入射光而言，它是一個(gè)常數(shù)。比色法中常把 稱為透光率（transmittace)，用 T 表示，透光率和吸光度的關(guān)系如下：

    (8-3)

　　當(dāng) c以質(zhì)量濃度(g·L-1)為單位時(shí)，吸光系數(shù)用a表示，稱為質(zhì)量吸光系數(shù)；當(dāng)c以mol·L^-1為單位時(shí)，吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)，用ε表示，其單位是L·mol^-1·cm^-1。吸光系數(shù)越大，表示溶液對(duì)入射光越容易吸收，當(dāng)c有微小變化時(shí)就可使A有較大的改變，因此測(cè)定的靈敏度較高。一般ε值在10³以上可進(jìn)行比色分析。

　　如果測(cè)定某種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)單色光的吸收程度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖可得一條曲線，即物質(zhì)對(duì)光的吸收曲線，可準(zhǔn)確地描述物質(zhì)對(duì)光的吸收情況。

　　圖8-3是幾種不同濃度KMnO₄溶液的吸收曲線，溶液在波長(zhǎng)525nm附近的吸收最強(qiáng)，而對(duì)其它波長(zhǎng)的光吸收較弱。光吸收程度最大處的波長(zhǎng)叫做最大吸收波長(zhǎng)，用λmax表示。不同溶液的KMnO₄溶液所得的吸收曲線，最大吸收波長(zhǎng)都一致，只是相應(yīng)的光被吸收的程度不同。

  圖8-3  KMnO₄溶液的吸收光譜曲線

　　吸收曲線可作為比色分析法中波長(zhǎng)選定的依據(jù)，測(cè)定時(shí)一般選擇λmax的單色光作為入射光。這樣即使被測(cè)物質(zhì)含量較低也可得到較大的吸光度，因而可使分析的靈敏度較高。

　　若所測(cè)定的溶液無(wú)色，可在測(cè)定前加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，通過(guò)與待測(cè)成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使溶液顯色即可測(cè)定此待測(cè)成分。

　　例8-1  已知在525nm處KMnO₄溶液的ε＝2235L·mol^-1·cm^-1，若用2cm比色皿，為使所測(cè)得的透光率介于20%－65%之間，溶液的濃度范圍是多少？

　　 解：若T＝20%

　　 則

　　 若T＝65%

　　 則    c= 4.19×10^-5(mol·L^-1)

因此溶液的濃度范圍是1.56×10^-4 ~ 4.19×10^-5mol·L^-1。

第二節(jié)　　比色分析法的測(cè)定方法和應(yīng)用

　　一、目視比色法

　　用視力比較樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的顏色深淺以確定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法（visualcolorimetry)。

　　目視比色法的根據(jù)是：被測(cè)物質(zhì)和已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同樣條件下顯色，當(dāng)兩溶液液層的厚度相等且顏色深度相同，　即吸收度相同時(shí)，則兩者的濃度相等。A_標(biāo)＝A_樣，c_標(biāo)L_標(biāo)＝c_樣L_樣；當(dāng)L_標(biāo)＝L_樣時(shí)，c_標(biāo)＝c_樣。

　　目視比色法常用的是標(biāo)準(zhǔn)系列法。

　　標(biāo)準(zhǔn)系列法（standard series method)是在納氏比色管中進(jìn)行測(cè)定的。納氏比色管是一套由同種玻璃制成的大小形狀完全相同的平底玻璃管，有的具有玻塞或塑料塞。其容積有10mL、20mL、50mL、100mL等數(shù)種，管上具有標(biāo)線以表示容量。比色管放在下面有反光鏡的比色管架上進(jìn)行比色。

　　標(biāo)準(zhǔn)系列法的操作步驟如下：

先配制一個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后取一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液按照由少至多的次序置于規(guī)格相同的比色管中，加入顯色劑并稀釋至一定體積，搖勻，成為一系列顏色由淺至深的標(biāo)準(zhǔn)色階。另取一定量的樣品溶液，用同樣方法，在同樣條件下使其顯色并稀釋至相同的體積，制成樣品比色液（其顏色深度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)色階范圍內(nèi))。然后將樣品比色液與標(biāo)準(zhǔn)色階逐一比較，如樣品比色液的顏色與標(biāo)準(zhǔn)色階中某一標(biāo)準(zhǔn)比色液的顏色相同，則此兩者的濃度相等。如樣品比色液的顏色介于某兩標(biāo)準(zhǔn)比色液的顏色之間，則可取它們濃度的平均值作為樣品比色液的濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)求出樣品溶液的濃度: 

c_樣＝與樣品液等色度的標(biāo)準(zhǔn)管溶液濃度×稀釋倍數(shù)。

　　比色時(shí)可在自然光下進(jìn)行。以漫射光為光源，各管受光情況一致，比色時(shí)可用平視法和俯視法，也可觀察反光鏡中各管顏色深淺的影像。我們常用的pH試紙就是采用的標(biāo)準(zhǔn)系列法。

　　標(biāo)準(zhǔn)系列法所用儀器簡(jiǎn)單，操作方便，液層厚度大，適用于測(cè)定低濃度溶液，在野戰(zhàn)條件下應(yīng)用廣泛。但比色時(shí)須先配制一系列標(biāo)準(zhǔn)色階，而標(biāo)準(zhǔn)色階不宜長(zhǎng)期保存需臨時(shí)配制，同時(shí)目視比色也容易引入視覺(jué)誤差，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。

二、分光光度法

（一)分光光度法

　　 分光光度法（spectrophotometry)是以鎢燈或氫燈光作光源，經(jīng)單色光器分光后，以所需波長(zhǎng)的單色光作入射光，通過(guò)測(cè)定溶液吸光度來(lái)求算溶液中被測(cè)物質(zhì)含量的一種分析方法。所用的儀器稱為分光光度計(jì)（spectrophtometer)。分光光度計(jì)的型號(hào)很多，但其基本原理相似，主要部件表示如下：

   　　　 光源→單色器→吸收池→檢測(cè)器→放大器→指示器

　　1. 光源　可見(jiàn)分光光度計(jì)中，采用6~12V的鎢燈作光源，其最適宜的波長(zhǎng)范圍是360~1000nm，為使光的強(qiáng)度穩(wěn)定，須用穩(wěn)壓裝置來(lái)穩(wěn)定電壓。紫外分光光度計(jì)中的光源為氫燈和鎢燈各一個(gè)，可按需要進(jìn)行轉(zhuǎn)換。氫燈可用于200～400nm波長(zhǎng)范圍的紫外分光光度法測(cè)定。

　  2. 單色器　分光光度計(jì)采用單色器來(lái)控制波長(zhǎng)。它可以把連續(xù)波長(zhǎng)的光通過(guò)棱鏡或光柵、狹縫和準(zhǔn)直鏡等分解成所需波長(zhǎng)的單色光。狹縫寬度應(yīng)適中，狹縫太寬，單色光純度差；狹縫太窄，則光通量過(guò)小，影響測(cè)量靈敏度。

3. 吸收池  分光光度計(jì)中用來(lái)盛放溶液的容器稱為吸收池或比色皿。它是用無(wú)色透明、厚度均勻的玻璃制成的。其透光的兩面嚴(yán)格平行。同一系列的測(cè)定中，所用的比色皿必須配套，即同一配套比色皿盛有同一溶液在同一波長(zhǎng)時(shí)測(cè)得的透光率不得越過(guò)0.5%。實(shí)驗(yàn)時(shí)可根據(jù)溶液的濃度不同選擇0.5、1.0、2.0、3.0cm不同規(guī)格的比色皿。比色皿要保持清潔，透光面要注意保護(hù)，不得用手直接接觸或用粗糙的濾紙擦拭，以免劃傷表面，影響吸收程度，若外壁有液珠，應(yīng)用濾紙吸干后再用擦鏡紙擦凈。紫外分光光度計(jì)的吸收池須用紫外光易通過(guò)的石英制造。

4. 檢測(cè)器  可見(jiàn)分光光度計(jì)中的檢測(cè)器一般用光電管，它是由一個(gè)陽(yáng)極和一個(gè)用光敏感材料制成的陰極組成的真空二極管。當(dāng)光照射到陰極時(shí)，金屬表面發(fā)射電子，流向電勢(shì)較高的陽(yáng)極而產(chǎn)生電流。紫外分光光度計(jì)的光電管有紅敏（625～1000nm)和藍(lán)敏（200～625nm)兩只，可通過(guò)手柄轉(zhuǎn)換。光越強(qiáng)，陰極表面發(fā)射的電子越多，產(chǎn)生的光電流也越大。

5. 放大器和指示器   光電管產(chǎn)生的電流較弱，約為1×10^-6A，需經(jīng)放大器放大后輸入指示器。指示器一般為微安電表、記錄器、數(shù)字顯示器和打印機(jī)等。在微安電表的標(biāo)尺上同時(shí)刻有吸光度和透光率，如圖8-4所示。透光率刻度是等分的。因吸光度與透光率是負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，所以吸光度刻度是不均勻的。

    圖8-4   吸光度與透光率標(biāo)尺

圖8-5  72系列分光光度計(jì)光學(xué)系統(tǒng)示意圖

　　很多精密型分光光度計(jì)采用屏幕顯示吸收光譜、操作條件及各項(xiàng)數(shù)據(jù)，并可與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，使測(cè)定更為方便，高級(jí)職稱考試網(wǎng)也擴(kuò)大了分光光度法的應(yīng)用范圍。圖8-5為72系列分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)示意圖。由光源發(fā)出的連續(xù)輻射光線射于聚光鏡上，經(jīng)平面鏡轉(zhuǎn)角90°反射到入射狹縫，射入單色器。入射光經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直鏡反射后，以一束平行光射向背后鍍鋁的棱鏡而發(fā)生色散，從棱鏡色散后的光線經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直鏡反射在出射狹縫上，再經(jīng)過(guò)聚光鏡后進(jìn)入比色皿。經(jīng)溶液吸收后的透射光通過(guò)光門照射在光電管上轉(zhuǎn)換為光電信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大后輸入檢流計(jì)，由電表直接顯示出吸光度。

（二)可見(jiàn)分光光度法的測(cè)定方法

　　可見(jiàn)分光光度法常用于定量測(cè)定，最常用的測(cè)量方法有如下兩種。　

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線法是分光光度法中最常用的方法。配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長(zhǎng)的入射光。測(cè)定時(shí)先以空白溶液調(diào)節(jié)透光率100%，然后分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，叫做標(biāo)準(zhǔn)曲線（或稱工作曲線)。然后將被測(cè)溶液置于吸收池中，在相同條件下，測(cè)量其吸收度，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的含量。該方法對(duì)于經(jīng)常性批量測(cè)定十分方便，采用此法時(shí)，應(yīng)注意使標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測(cè)溶液在相同條件下進(jìn)行測(cè)量，且溶液的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

在測(cè)定溶液吸光度時(shí)，為了消除溶劑或其它物質(zhì)對(duì)入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面對(duì)光的反射等與被測(cè)物質(zhì)吸收無(wú)關(guān)的因素的影響，必須采用空白溶液（又稱參比溶液)作對(duì)照。常用的空白溶液有下列三種。

  （1)溶劑空白   當(dāng)顯色劑及制備試液的其它試劑均無(wú)色，且溶液中除被測(cè)物外無(wú)其它有色物質(zhì)干擾時(shí)，可用溶劑作空白溶液，這種空白溶液稱為溶劑空白。

  （2)試劑空白   若顯色劑有色，試樣溶液在測(cè)定條件下無(wú)吸收或吸收很小時(shí)，可用試劑空白進(jìn)行校正。所謂試劑空白，是按顯色反應(yīng)相同的條件加入各種試劑和溶劑(不加試樣溶液)后所得溶液，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線法中濃度為“0”的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

  （3)試樣空白   當(dāng)試樣基體有色(如試樣中混有其它有色離子)，但顯色劑無(wú)色，且不與試樣中被測(cè)成分以外的其它成分顯色時(shí)，可用試樣空白校正。所謂試樣空白，是指不加顯色劑但按顯色反應(yīng)相同條件進(jìn)行操作的試樣溶液。

　  2. 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法

　　若僅對(duì)個(gè)別樣品進(jìn)行測(cè)定，且A－ｃ曲線線性良好，可不作標(biāo)準(zhǔn)曲線而直接比較測(cè)定結(jié)果。

　　先配制一個(gè)與被測(cè)物質(zhì)溶液的濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與被測(cè)溶液在相同條件下測(cè)定吸光度，根據(jù)下式可以計(jì)算。

A_標(biāo)= K_標(biāo)b_標(biāo)c_標(biāo)

A_測(cè)= K_測(cè)b_測(cè)c_測(cè)

　　由于使用同一波長(zhǎng)的入射光，采用同樣的比色皿，測(cè)定同樣的物質(zhì)，所以

K_標(biāo)= K_測(cè)

b_標(biāo)=b_測(cè)

因此   

即   

　�。ㄈ�)可見(jiàn)分光光度法的應(yīng)用—鐵的含量測(cè)定

　　1. 原理  分析測(cè)定溶液中鐵的含量有硫氰酸鹽顯色法、磺基水楊酸法及鄰菲羅啉顯色法等各種方法�，F(xiàn)以磺基水酸楊法為例介紹鐵的含量測(cè)定。

在不同酸度下，F(xiàn)e^3＋和磺基水楊酸生成組成不同的配合物。若控制溶液pH值在8～11.5條件下顯色，可生成配位數(shù)為6的黃色三磺基水楊酸合鐵配合物。反應(yīng)式如下：

Fe³⁺+3HSal^- [Fe(Sal)₃]^3-+3H⁺

　　溶液的最大吸收波長(zhǎng)為420nm，因此可在420nm處進(jìn)行測(cè)定。此方法適合于測(cè)定無(wú)大量Cu²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺等離子存在的溶液中鐵離子的含量。

　　2、操作步驟

　　(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制  稱取一定量硫酸鐵銨［NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O］， 用蒸餾水溶解，加適量硫酸酸化，配制成含F(xiàn)e^3＋0.1g·L^－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成含F(xiàn)e^3＋0.025mg·L^－1 的操作液。

　　取25mL容量瓶6只，編號(hào)后分別加入操作溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，各加入10%NH₄Cl溶液2mL和10%磺基水楊酸溶液2mL，滴加氨水至溶液由紫紅色變?yōu)辄S色，并使氨水稍過(guò)量，然后用NH₄Cl－NH₃ 緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，以1號(hào)為空白，在420nm處依次測(cè)定吸光度。以Fe^3＋含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　(2)樣品的測(cè)定　取25mL容量瓶1只，準(zhǔn)確加入經(jīng)過(guò)處理的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的被測(cè)溶液，按上面標(biāo)準(zhǔn)系列配制的同樣方法加入等量的顯色劑和緩沖溶液，在相同的條件下測(cè)定被測(cè)溶液的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線找出樣品溶液的濃度，根據(jù)樣品溶液的稀釋倍數(shù)，求出樣品的含量。

　　例8-2  用鄰二氮菲測(cè)定鐵時(shí)，已知每毫升試液中含F(xiàn)e^2＋0.500μg，用2.00cm吸收池于508nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.198，計(jì)算三（鄰二氮菲)合鐵（Ⅱ)配合物的ε（508nm處)。

解：cFe²⁺ = ×10^-6×1000 = 8.96×10^-6(mol·L^-1)

因?yàn)?A = εbc

所以 ε= = 1.10×10^-4(mol·L^-1·cm^-1)

習(xí)  題

　　1. 為什么KMnO₄、CuSO₄溶液呈現(xiàn)不同的顏色，它們各吸收了哪些波長(zhǎng)范圍的光？

　　2. 什么是質(zhì)量吸光系數(shù)？什么是摩爾吸光系數(shù)？?jī)烧哧P(guān)系如何？為什么要選用波長(zhǎng)為λmax的單色光進(jìn)行分光光度法測(cè)定？

　　3. 什么是吸收光譜？什么是標(biāo)準(zhǔn)曲線？各有什么實(shí)際應(yīng)用？

　　4. 分光光度計(jì)主要由哪些部分組成？各起什么作用？

　　5. 已知透光率為20%和80%，分別計(jì)算其吸光度。已知吸光度為0.25和0.56，分別計(jì)算其透光率。

6. 已知某化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmol·L^-1的溶液，在480nm波長(zhǎng)處用2.00cm吸收池測(cè)得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)ε和質(zhì)量吸光系數(shù)α。

答案

　　5. A：0.70，0.097；T：56%，28%

　　6. ε= 1.33×10³mol·L^-1·cm^-1；α= 5.30L·g^-1·cm^-1