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1 材料與方法
1.1 RNA提取、純化及檢測
WP3的培養(yǎng)選用海水培養(yǎng)基2216E(5g/L蛋白胨，1g/L酵母膏，0.1g/L磷酸鐵，34g/L NaCL)。實驗用差異顯示引物見參考文獻[4]，引物來自大腸桿菌基因組序列，其中反轉(zhuǎn)錄引物中含TTA，TCA等終止密碼，而PCR引物中則含ATG起始密碼，這樣得到的每個產(chǎn)物都盡量包含起始和終止密碼的開放閱讀框。RNA提取按TRIzol方法進行(見MBI操作說明)，提取好的RNA樣品要通過DNaseI(Takara公司，日本)處理以去掉殘留的基因組DNA污染。
1.2 RAP_PCR建立及獲得差異片段
RNA樣品通過DNaseI處理去除基因組污染，然后用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司，美國)42℃90min反轉(zhuǎn)錄。通過RAP_PCR擴增后，用質(zhì)量分數(shù)8%的聚丙烯酰胺凝膠(通過尿素變性)電泳，用Scientific電泳系統(tǒng)(CBS公司，美國)1200W恒壓電泳4h后至二甲苯砸青并到達玻璃板底部。尋找差異條帶，將其小心用無菌刀片切割回收后95℃20min處理用作模板重新擴增，擴增得到的片段送至上海生工克隆測序。
1.3 差異片段的重新鑒定
選用RT_PCR，RNA點雜交，熒光實時定量PCR對有關差異條帶進行重新驗證。RT_PCR所用引物跟差異顯示一樣。RNA點雜交法：用質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖純化試劑盒純化，純化后一部分制備探針。準備好純化的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR檢驗cDNA質(zhì)量合格后純化，用地高辛標記(按試劑盒提供的方法檢測標記效果)，取回收的電泳差異條帶重擴增的PCR產(chǎn)物50ng，94℃變性5min，點樣器將樣品點到尼龍膜上，進行紫外交聯(lián)，按25ng/mL取標記好的探針，在雜交爐雜交，隨后進行免疫檢測，檢測所回收差異片段的真假。熒光實時定量PCR采用SYMBOL green I染料。所需引物經(jīng)ABI軟件引物設計軟件[5]。
2 結(jié)果醫(yī).學.全.在.線bhskgw.cn
第2期 李升康等.不同方法鑒定差異顯示技術RAP_PCR得到差異基因的比較
2.1 RT_PCR驗證中的看家基因
在做RT_PCR之前，需要找看家基因作為參比標準。通過RNA點雜交，發(fā)現(xiàn)pepN編碼aminopeptidase N在不同鹽濃度(質(zhì)量分數(shù)1%、7%的NaCl 2216E海水培養(yǎng)基)和高鹽濃度(質(zhì)量分數(shù)20%的NaCl)刺激條件下為組成性表達(圖1)。從后來的基因芯片雜交結(jié)果看，pepN在其他脅迫條件下的表達均無明顯變化。因此，pepN可作為RT_PCR中的陽性對照。圖1 pepN在不同脅迫條件下組成性表達
2.2 差異片段的重新驗證
2.2.1 RT_PCR 為保證RT_PCR結(jié)果的可靠性，3次獨立實驗中提取的不同鹽濃度RNA反轉(zhuǎn)錄作為模板。而對每個片段而言，又獨立地作2次RT_PCR以保證結(jié)果的重現(xiàn)性。在隨機選取的3個測序片段中，其中一個為假陽性。圖2示以pepN為內(nèi)對照，通過半定量RT_PCR發(fā)現(xiàn)其余2個為差異表達片段。圖2 RT_PCR檢測差異表達片段
2.2.2 RNA點雜交 以pepN為內(nèi)對照，對Y1、Y2片段進行地高辛標記，與來自不同鹽濃度生長菌體的RNA進行雜交，結(jié)果可見Y1和Y2在不同鹽濃度中存在差異表達，其中Y1上調(diào)，Y2下調(diào)(圖3)。圖3 RNA點雜交驗證差異表達片段
Fig.3 The detection of the differentially_expressed fragments by RNA dot hybridization
2.2.3 熒光實時定量PCR 首先優(yōu)化了熒光實時定量PCR的擴增體系，分別檢測Y1和Y2的擴增曲線和溶解曲線(圖4、5)。通過熒光實時定量PCR實驗表明，得到的差異表達片段是Y1表達上調(diào)3.598倍，Y2表達下調(diào)0.302(圖6醫(yī).學.全.在.線bhskgw.cn)。
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