醫(yī)學(xué)論文范文:人前腦啡肽原綠色熒光蛋白真核表達載體的構(gòu)建

F：5ˊGAAAAGCTTATGGCGCGGTTCCTGACA3ˊ

R：5ˊGCCGGATCCTTAAAATCTCATAAATCCTC 3ˊ通過RT�睵CR擴增PENK目的基因。總RNA先70℃變性5 min，冰浴冷卻后加入反應(yīng)體系，反應(yīng)物總體積為20 μL，離心混勻后，置于42℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，然后移至70℃水浴5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物為人腦組織的總cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 μL進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR的擴增產(chǎn)物。

1.5 T�睵ENK載體的構(gòu)建 利用膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物的DNA目的片段純化回收，將回收片段與T載體連接，轉(zhuǎn)染大腸桿菌 JM109，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，對陽性克隆擴大培養(yǎng)提取T�睵ENK重組質(zhì)粒。

1.6 pEGFP�睠3�睵ENK真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 按1∶3比例將T�睵ENK載體和pEGFP�睠3載體混合后用HindⅢ和BamHI雙酶切成線狀并經(jīng)電泳回收，混合后16℃連接過夜，連接產(chǎn)物用42℃水浴熱擊法轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細菌內(nèi)鋪含Amp+的瓊脂平板，倒置37℃培養(yǎng)12～16 h，通過菌落PCR和酶切法鑒定陽性克隆，并取PCR陽性克隆菌送上海生物工程公司測序。

2 結(jié)果

2.1 人前腦啡肽原基因的克隆 通過RT�睵CR法擴增出的PENK基因與預(yù)測的基因基本一致(見圖1)。

1：Marker 2：針對pEGFP�睠3設(shè)計的引物所擴PENK基因

圖1 人前腦啡肽原基因的PCR電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測序結(jié)果 從圖2中可以看出，酶切出約800 bp(PENK)和5 000 bp (pEGFP�睠3)的DNA片段。與理論計算一致，命名為pEGFP�睠3�睵ENK。測序結(jié)果與GenBank報道的序列完全吻合，載體構(gòu)建成功醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站bhskgw.cn。

1：Marker 2、3：酶切新載體所得PENK和pEGFP�睠3片段

圖2 構(gòu)建新載體的酶切電泳圖

3 討論

疼痛治療是醫(yī)學(xué)界的長期研究課題。目前緩解疼痛的主要治療藥物仍是阿片類藥物，其成癮性和毒副作用大等特點又使其臨床應(yīng)用受限。腦啡肽是一種神經(jīng)遞質(zhì)，阿片受體的內(nèi)源性配體,通過阿片受體介導(dǎo)的抑制腺苷酸環(huán)化酶、抑制磷脂酰肌醇水解等細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。腦啡肽包括甲硫氨酸腦啡肽(M�睧K)和亮氨酸腦啡肽(L�睧K)具有鎮(zhèn)痛效果好、副作用少的優(yōu)點，但腦腓肽易被腦啡肽酰A或B降解成無活性的衍生物，因此找到一種持續(xù)分泌內(nèi)源性腦啡肽，且具有臨床可行性的方法，成為研究的主要方向。前腦啡肽是腦腓肽的前體,在翻譯過程中經(jīng)不同的蛋白酶降解形成上述兩個具有鎮(zhèn)痛作用的活性阿片肽。前腦啡肽源基因是慢性疼痛基因治療中一種較為理想的基因選擇，是目前國內(nèi)外研究的熱點。楊茂元等[6]先用在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將人前腦啡肽源基因(human preproenkephalin，HPPE)轉(zhuǎn)染鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞，然后將該細胞移植入大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔進而評價神經(jīng)性疼痛治療的效果，結(jié)果表明成纖維細胞系NIH/3T3能表達β�矁�(nèi)啡肽基因，HPPE作為轉(zhuǎn)基因鎮(zhèn)痛治療難治性疼痛是可行的�；�因鎮(zhèn)痛研究中常用的載體有病毒載體與非病毒載體，病毒載體攜帶外源基因和相關(guān)基因元件，并被包裝成病毒顆�？烧�合入不能分裂增殖神經(jīng)元細胞內(nèi)進行表達。在體內(nèi)外實驗中使用較多，但其來源于病毒存在自身免疫原性和造成細胞病理改變等特性，其臨床應(yīng)用也受到限制[7]。而非病毒基因載體則以其設(shè)計靈活、低免疫原性、低毒性、低致癌性、外源基因整合幾率低、無基因插入片段大小限制、易制備、長期表達等優(yōu)點，成為基因治療新選擇。在國內(nèi)華中科技大學(xué)徐穎等[8]人，將前腦啡肽基因連接到真核載體上，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),建立四環(huán)素調(diào)控表達人前腦啡肽原基因的大鼠星形膠質(zhì)細胞系，將來移植到體內(nèi)，可依據(jù)疼痛程度，調(diào)控疼痛基因表達時間與水平，這使得基因治療與臨床應(yīng)用又近了一步。

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