| 公開(公告)號(hào) | CN1322135C |
| 公開(公告)日 | 2007.06.20 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410060813.6 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.09.09 |
| 專利名稱 | 細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用 |
| 主分類號(hào) | C12N15/79(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/79(2006.01)I;C12N15/24(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 武漢大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 章曉聯(lián);瞿少剛;周 翔;吳建國(guó);陳 明;李平飛 |
| 地址 | 430072湖北省武漢市武昌珞珈山 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 武漢宇晨專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 王敏鋒 |
| 國(guó)省代碼 | 湖北;42 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，它包括下列步驟： A、目的基因的擴(kuò)增與純化，根據(jù)人IL-24 GeneBank序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’GCAGATCTAATTTTCAACAGAGGCTG-3’，含有BglII酶切位點(diǎn)；下游引物：5’CGGTCGACTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3’，含有Sal I酶切位點(diǎn)，以插入人IL-24完整編碼區(qū)基因的質(zhì)粒TRAPIL-24為模板，采用上述引物從人IL-24 N端編碼的第2個(gè)氨基酸開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2分鐘，以95℃變性36秒，56℃退火36秒，72℃延伸1分鐘24秒，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，再以72℃延伸5分鐘，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下后，用試劑盒回收純化； B、重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24構(gòu)建與鑒定，將純化的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用BglII和SalI雙酶切后，分別用試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下定向連接IL-24片段至pEGFP-C1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，在LB培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用BglII和SalI雙位點(diǎn)單、雙酶切鑒定，測(cè)序。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種細(xì)胞因子IL-24真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用，其步驟是：首先是目的基因的擴(kuò)增與純化，設(shè)計(jì)上引物和下引物，以質(zhì)粒TRAPIL-24為模板，采用人IL-24N端編碼的第2個(gè)氨基酸開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的條帶切下后，用試劑盒回收純化；其次是重組質(zhì)粒pEGFP-C1-IL-24構(gòu)建與鑒定，將純化的PCR產(chǎn)物和載體pEGFP-C1用Bgl II和Sal I雙酶切后，分別用試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，連接片段，篩選培養(yǎng)，克隆，鑒定，測(cè)序。本發(fā)明包括證實(shí)重組細(xì)胞因子IL-24在治療肝癌、小腸癌、黑色素瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，操作方便，能抑制、預(yù)防和治療腫瘤的生長(zhǎng)。 |
| 國(guó)際公布 |
