| 公開(公告)號 | CN1944645A |
| 公開(公告)日 | 2007.04.11 |
| 申請(專利)號 | CN200610102042.1 |
| 申請日期 | 2006.10.17 |
| 專利名稱 | 利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C12N15/06(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 青島森淼生物技術(shù)研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 袁三平;鄒賢剛;鮮 建 |
| 地址 | 255068山東省青島市株州路177號惠特工業(yè)園A區(qū)5號樓2層 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 青島發(fā)思特專利商標(biāo)代理有限公司 |
| 代理人 | 蔡紹強(qiáng) |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法，其特征是該方法包括下述步驟： (1)選用哺乳動物的乳蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的調(diào)控區(qū)和表達(dá)框架，在乳蛋白基因的表達(dá)框架上建立唯一的酶切位點(diǎn)和乳蛋白分泌序列，然后將重組人的抗凝血酶III蛋白基因和腸激酶蛋白質(zhì)酶切序列連接在乳蛋白基因的表達(dá)框架上，轉(zhuǎn)基因載體的末端再連接一個篩選基因； (2)所構(gòu)建的載體經(jīng)DNA序列分析，確定人的抗凝血酶III蛋白基因與乳蛋白基因的DNA序列，并與乳蛋白基因本身的表達(dá)和功能基因的氨基酸組成一致； (3)用電穿孔或脂質(zhì)體誘導(dǎo)的方法，將人的抗凝血酶III蛋白基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的動物的體細(xì)胞中； (4)在培養(yǎng)基中對細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得篩選后的陽性細(xì)胞株；一部分細(xì)胞冷凍保存，一部分細(xì)胞用于制備DNA； (5)陽性細(xì)胞株的DNA，經(jīng)PCR和Southern雜交分析，確定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的細(xì)胞株； (6)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞株的細(xì)胞移入山羊成熟的去核卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，然后使供核細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞融合； (7)將克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中，經(jīng)妊娠獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊； (8)檢測轉(zhuǎn)人的抗凝血酶III蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白含量； (9)含有人的抗凝血酶III蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白的提純； (10)純化的重組人的抗凝血酶III蛋白的動物試驗(yàn)； (11)重組人的抗凝血酶III蛋白在人體上的應(yīng)用。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種利用乳腺生物反應(yīng)器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括：選哺乳動物的乳蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的調(diào)控區(qū)和表達(dá)框架，在框架上建立一個唯一的酶切位點(diǎn)，再將人AT-III蛋白基因功能部分，乳蛋白分泌序列和腸激酶蛋白質(zhì)酶切序列基因，連接在表達(dá)框架上，載體的末端再連接一個篩選基因；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的動物體細(xì)胞中；獲得含有人的AT-III蛋白基因的細(xì)胞株；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株移入山羊成熟的去核卵母細(xì)胞內(nèi)，使供核細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞融合；克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中，經(jīng)妊娠獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊；檢測轉(zhuǎn)基因動物乳汁中的人AT-III蛋白的含量和活性、提純；經(jīng)動物試驗(yàn)和人體試驗(yàn)；重組人AT-III蛋白在人體上的應(yīng)用。 |
| 國際公布 |
