| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1884520A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2006.12.27 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200610088289.2 |
| 申請(qǐng)日期 | 2006.07.10 |
| 專利名稱 | 人白介素-2與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品 |
| 主分類號(hào) | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N15/14(2006.01)I;C12N15/26(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C07K14/55(2006.01)I;C07K14/765(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 江南大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 李華鐘;金 堅(jiān);郭澤峰;王樹(shù)英;張蓮芬 |
| 地址 | 214036江蘇省無(wú)錫市惠河路170號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 時(shí)旭丹 |
| 國(guó)省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 人白介素-2與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是通過(guò)提取人外周血單核細(xì)胞mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄得到IL-2cDNA，并將IL-2cDNA克隆到pMD19T載體中，PCR從含IL-2cDNA的載體IL-2-pMD19T中直接擴(kuò)增得到IL-2cDNA；通過(guò)PCR從含HSA cDNA質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接IL-2cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的IL-2-HSA cDNA融合體插入到克隆載體；IL-2-HSA cDNA融合體在宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，IL-2-HSA cDNA融合體被整合到宿主的染色體中； (1)模板mRNA的提取 取用EDTA抗凝的人外周血10mL，在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞的分離：將血液小心加入盛有等量淋巴細(xì)胞分離液的離心管，注意不要破壞界面；將離心管配平后，放入離心機(jī)離心，1000rpm，8分鐘；取出離心管，用無(wú)菌的移液槍將外周血單核細(xì)胞云霧層小心取出，放入另外的潔凈試管中；加PBS懸浮，小心振蕩數(shù)次，800rpm，8分鐘，棄上清，加入1640培養(yǎng)基15ml，加青霉素和鏈霉素均至終濃度為100U/μl；植物血球凝集素梯度加入，分別加0.5ml×2，0.3ml×2，1.0ml×2；放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，30～48小時(shí)，按照Trizol的說(shuō)明書(shū)提取模板mRNA； (2)IL-2cDNA的反轉(zhuǎn)錄和克隆 RT體系：模板1μg mRNA溶液10μL；5×Reverse Transcription Buffer 4μL；10mM的dNTP 2μL；20U的RNase Inhibiter0.5μL；50pmol的Oligo(dT)181μL；5U的Amv Rewerse Transcriptase 1μL；DEPC H2O定容至20μL； 輕輕攪拌，在PCR儀上進(jìn)行cDNA的合成：42℃，60min，室溫放置10min，冰上放置2min，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆没蛘咧苯邮褂茫? 以RT-PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行如下擴(kuò)增，引物為： I-1：5′-TGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAG-3′ I-2：5′-GAAGGCCTGATATGTTTTAAGTGGGAAG-3′ 50μl的PCR反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的I-1和I-2各2μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，IL-2cDNA 1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl，PCR條件為：95℃充分變性5分鐘，94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆到pMD19 T-Vector中； (3)IL-2c DNA的擴(kuò)增 從含有人IL-2cDNA的質(zhì)粒IL-2-pMD19中用PCR的方法擴(kuò)增，引物如下： IH-1：5′-GGAATTCAAAAGAGCACCTTACTTCAAGTTCTAC-3′ IH-2：5′-ACCTCACTCTTGTGTGCATCAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3′ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的引物IH-1和引物IH-2各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，IL-2-pMD19 1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl，PCR條件為：95℃充分變性5分鐘，94℃變性1分鐘，57℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.4kb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段備用； (4)HSA cDNA的PCR擴(kuò)增 利用PCR從含有HSA cDNA質(zhì)粒中擴(kuò)增出HSA cDNA，所用的引物為： IH-3：5′-GCATCATCTCAACACTGACTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3′ IH-4：5′-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3′ 50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的引物IH-3和引物IH-4各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，含有HSAcDNA的質(zhì)粒pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃充分變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸150秒，循環(huán)30次； 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段備用； (5)IL-2cDNA和HSA cDNA的連接 利用重疊PCR融合IL-2cDNA和HSA cDNA，將IL-2cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后和HSAcDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后按照1∶1的摩爾比混合后作為模板，于50μl的反應(yīng)體系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補(bǔ)齊45μl；PCR條件為：95℃充分變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，循環(huán)10次后，向反應(yīng)體系中加入10μmol/L的IH-1和IH-4的引物各2.5μl，繼續(xù)做30個(gè)上述循環(huán)； 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.2kb的目標(biāo)條帶，再雙酶切并純化好的目標(biāo)片段IL-2-HAS和載體pMD19T按照1∶7的摩爾比用T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取白色菌落，接種于20ml100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒；通過(guò)PCR和EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆，并對(duì)重組質(zhì)粒EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序；陽(yáng)性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pMD19-IL-2-HSA，陽(yáng)性重組子命名為XL-1-Blue-pMD 19-IL-2-HSA； (6)融合蛋白IL-2-HSA的酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 取一支凍存 |
| 摘要 | 人白介素-2(IL-2)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長(zhǎng)效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，連接IL-2cDNA和HSAcDNA，中間不加入任何連接肽，得到的IL-2-HSA cDNA融合體在宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，被整合到宿主的染色體中；本發(fā)明的融合蛋白包括與人白介素-2至少85％序列同源的第一區(qū)和人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯�，進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入；宿主表達(dá)系統(tǒng)可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人白介素-2的生理特性的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。 |
| 國(guó)際公布 |
