公開(公告)號(hào)
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CN1277921C
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公開(公告)日
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2006.10.04
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200510048963.X
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申請(qǐng)日期
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2005.01.13
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專利名稱
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利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法
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主分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/866(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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浙江大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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吳小鋒;姚慧鵬;曹翠平
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地址
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310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號(hào)
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頒證日
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國際申請(qǐng)
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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杭州求是專利事務(wù)所有限公司
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代理人
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林懷禹
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國省代碼
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浙江;33
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主權(quán)項(xiàng)
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利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法,其特征在于:(1)人乳鐵蛋白基因的克隆:以人乳腺組織cDNA為模板,PCR基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人乳鐵蛋白基因,引物設(shè)計(jì)如下:正向引物:5′GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′,含有BamHI酶切位點(diǎn);反向引物:5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′,含有BamHI酶切位點(diǎn);PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下:一個(gè)循環(huán),94℃模板變性50秒;30個(gè)循環(huán),55℃退火30秒,70℃延伸2分鐘;最后1個(gè)循環(huán),70℃延伸10分鐘;利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析,并用PCR純化試劑盒純化,獲得全長為2136bp的人乳鐵蛋白基因,隨后將人乳鐵蛋白基因克隆入3.9kb載體pCR2.1,獲得pCR2.1-LF,利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認(rèn)克隆人乳鐵蛋白基因順序正確性;(2)含有人乳鐵蛋白基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到人乳鐵蛋白基因片段,然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa獲得重組體pBlueBacHisa-LF;通過共轉(zhuǎn)染在昆蟲細(xì)胞內(nèi)與構(gòu)建的雜交桿狀病毒HyNPVDNA發(fā)生同源重組產(chǎn)生重組病毒,共轉(zhuǎn)染的方法為:1μgpBlueBacHisa-LFDNA和15μgHyNPVDNA混合,并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin,最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl;將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞,先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,換成含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基,27℃培養(yǎng)5天,收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液,用來篩選重組病毒;重組病毒通過3輪空斑篩選,最終獲得高濃度純化的病毒溶液,濃度為108pfu/ml,將此重組病毒命名為HyNPV-LF;(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組人乳鐵蛋白純化:使用家蠶幼蟲5齡起蠶,接種上述重組病毒HyNPV-LF進(jìn)行感染表達(dá);接種前,將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘,注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml,采用皮下注射的方法,每條家蠶注射20μl,注射1小時(shí)后給桑,在23-25℃下飼養(yǎng);感染后的三天內(nèi),看不到明顯的癥狀,到第四天,幼蟲開始食欲減弱,漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀;感染后第五天或第六天,感染的幼蟲大部分死亡,在此之前收集家蠶幼蟲;將幼蟲的血淋巴作為重組人乳鐵蛋白純化的起始材料,使用以下方法收集血淋巴:在15ml收集管的上方,將幼蟲向背面彎曲,用一只手固定幼蟲的頭部和尾部,讓腹部和腹足伸向外邊;用石蠟?zāi)っ芊獾?5號(hào)針頭刺破腹足收集血液,讓血液直接滴進(jìn)收集管中,為了防止血液氧化變黑,預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT,使其終濃度為1mmol/L;從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液進(jìn)行稀釋,所述非變性緩沖液為:Na3PO450mmol/L,NaCl0.5mol/L,pH8.0;樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱,最后,重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫,通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白,結(jié)果表明獲得的重組人乳鐵蛋白非常純一,從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量為400μg。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法。利用申請(qǐng)人構(gòu)建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體,構(gòu)建了含有人乳鐵蛋白基因的重組病毒。利用家蠶作為重組病毒的宿主,表達(dá)、生產(chǎn)了重組人乳鐵蛋白。解決了人乳鐵蛋白在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)。家蠶幼蟲體內(nèi)表達(dá)的重組人乳鐵蛋白大部分分泌在家蠶血淋巴中,非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取,利用親和層析法純化了重組的人乳鐵蛋白,從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量高達(dá)400μg。利用基因工程技術(shù)用家蠶作為表達(dá)載體可以大量生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白,為它在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。
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國際公布
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