| 公開(公告)號(hào) | CN1256426C |
| 公開(公告)日 | 2006.05.17 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410060667.7 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.07.29 |
| 專利名稱 | 一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N9/00(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N9/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 南昌市萬華生化制品有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 張萬山;劉蘭花;李菊根;王啟要 |
| 地址 | 330029江西省南昌市南昌民營科技園賢湖工業(yè)區(qū)B4-2 |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南昌洪達(dá)專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 劉凌峰 |
| 國省代碼 | 江西;36 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法，其特征是它包括親和雙水相萃取劑的制備、親和雙水相萃取體系的建立和純化抑肽酶的親和雙水相萃取工藝，具體步驟工藝如下：(1)將胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上制備親和雙水相萃取劑：首先活化甲氧基化的聚乙二醇，即MPEG：稱取MPEG100g和無水碳酸鈉20g，溶于苯500ml中，加入均三氯三嗪1.5g，80℃攪拌回流24小時(shí)，離心，將上清液傾入石油醚中，溫度控制在30-60℃中，得活化MPEG粗品沉淀，抽濾，將粗品用體積比為1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀，同樣溶解、沉淀，反復(fù)5次，抽干，即得到活化的MPEG；然后用活化后MPEG與胰蛋白酶進(jìn)行偶聯(lián)：取活化后的MPEG3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂緩沖液中，然后加入胰蛋白酶，攪拌，偶聯(lián)條件為15℃、8小時(shí)，胰蛋白酶∶MPEG的摩爾比為1∶5，pH值7.0，采用20KD的超濾膜進(jìn)行超濾去掉未偶聯(lián)的MPEG；(2)親和雙水相萃取體系的建立：將胰蛋白酶-MPEG、硫酸銨溶液和抑肽胰粗提液加入到燒杯中，雙水相系統(tǒng)的總體積為25ml，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH值，在500rpm的轉(zhuǎn)速下離心15min，分別測定上下相的體積、雙水相中的抑肽酶活性及總蛋白的含量，建立的親和雙水相萃取體系的萃取條件為：萃取溫度為20-30℃、萃取體系中萃取劑的濃度為8-16％W/V、(NH4)2SO4的濃度為10-20％W/V、pH值為6.0-8.0、攪拌萃取時(shí)間為30-45min、萃取體系抑肽酶粗提液中初始蛋白濃度為5-25mg/ml；(3)純化抑肽酶的親和雙水相萃取工藝：取新鮮牛肺20Kg，經(jīng)過硫酸酸解后，進(jìn)行板框過濾，濾液調(diào)整pH值為7.0-8.0后成為抑肽酶粗提液，用于親和萃取，每次親和萃取體系的的體積定為1L，平均每批產(chǎn)品萃取50次，每批產(chǎn)品的處理量達(dá)到0.2億KIU，平均萃取能力為40萬KIU/次，親和萃取后含抑肽酶的上相組分經(jīng)過調(diào)整pH值至1.5-2.0后用截留分子量為10KD的超濾膜進(jìn)行超濾后的濾出液過3KD的超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽和濃縮，截留液重新用于下一批親和萃取的萃取劑，將從上述操作中獲得的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥獲得高純度抑肽酶。 |
| 摘要 | 一種從牛肺中直接提取純化抑肽酶的方法，它是將胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上，并獲得適當(dāng)分子量的胰蛋白酶-PEG聚合物，從而建立親和雙水相萃取體系，牛肺經(jīng)過除雜、切塊、搗碎后用硫酸酸解，然后過濾，濾液經(jīng)過親和雙水相萃取后，最終的上相經(jīng)過超濾脫鹽和冷凍干燥后獲得高純度的抑肽酶產(chǎn)品。本發(fā)明制得的產(chǎn)品符合英國藥典98版對(duì)于抑肽酶產(chǎn)品的要求，即大分子物質(zhì)不得檢出(分子篩層析)。產(chǎn)品的效價(jià)達(dá)到6300KIU/mg以上。 |
| 國際公布 |
