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重組人骨形成蛋白4和7在甲醇酵母中的高效表達(dá)

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1513979A  
公開(kāi)(公告)日 2004.07.21  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN03136581.7  
申請(qǐng)日期 2003.05.20  
專利名稱 重組人骨形成蛋白4和7在甲醇酵母中的高效表達(dá)  
主分類號(hào) C12N1/19  
分類號(hào) C12N1/19;C12N15/81;C12N15/12;C12P21/02;C07K14/435;//(C12N1/19,C12R1∶84)  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 福建師范大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 張彥定;陳一平;黃義德  
地址 350007福建省福州市福州倉(cāng)山上三路8號(hào)  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu)  
代理人  
國(guó)省代碼 福建;35  
主權(quán)項(xiàng) 一種高效表達(dá)重組人骨形成蛋白的基因工程甲醇酵母菌株,其特征在于在甲醇酵母Pichia pastoris的基因組DNA中整合了人骨形成蛋白成熟肽序列,并能在胞外高效表達(dá)重組人骨形成蛋白。  
摘要 本發(fā)明涉及應(yīng)用甲醇酵母高效表達(dá)人骨形成蛋白技術(shù),尤其涉及根據(jù)酵母偏愛(ài)密碼子對(duì)人骨形成蛋白成熟肽序列進(jìn)行定點(diǎn)突變技術(shù)。其特征是用含人BMP4和7cDNA序列的質(zhì)粒pBluescript KS-BMP4和pBluescript KS-BMP7為模板,PCR擴(kuò)增得到人BMP4和7成熟肽cDNA序列。利用簡(jiǎn)化的重疊PCR技術(shù)分別對(duì)人BMP4和7成熟肽cDNA序列中精酸密碼子進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變后的序列作為模板克隆到甲醇酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K中并轉(zhuǎn)化到甲醇酵母GS115內(nèi)。通過(guò)篩選并獲得陽(yáng)性克隆。構(gòu)建好的工程菌在BMGY和BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng),經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后,高效表達(dá)重組人骨形成蛋白。本發(fā)明方法可高效表達(dá)分泌型重組人BMPs。通過(guò)定點(diǎn)突變,表達(dá)量提高了至少5倍,達(dá)到0.2mg/ml以上。重組人BMPs可用于骨科及相關(guān)臨床治療。  
國(guó)際公布  
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