| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1152965C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2004.06.09 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN98807440.0 |
| 申請(qǐng)日期 | 1998.06.15 |
| 專利名稱 | 利用復(fù)合競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)定量測(cè)定基因表達(dá)的方法 |
| 主分類號(hào) | C12Q1/68 |
| 分類號(hào) | C12Q1/68;B01L7/00;B01L3/00 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | 1997.6.16 US 08/876,766 |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 俄亥俄醫(yī)學(xué)院 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | J·C·威利;E·L·克勞福德 |
| 地址 | 美國(guó)俄亥俄 |
| 頒證日 | 2004.06.09 |
| 國(guó)際申請(qǐng) | PCT/US1998/012420 1998.6.15 |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | 2000.01.20 |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 樊衛(wèi)民 |
| 國(guó)省代碼 | 美國(guó);US |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種定量測(cè)定靶基因的基因表達(dá)的方法，它包括：(a)分離靶基因和持家基因的細(xì)胞mRNA，其經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄并在競(jìng)爭(zhēng)性模板存在下被特異性擴(kuò)增，得到各靶基因與各持家基因之比，將該比值用于估計(jì)各靶基因的基因表達(dá)量，方法是通過(guò)進(jìn)行如下混合物的同時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，混合物中含有下列成分：i)各靶基因的至少一個(gè)寡核苷酸引物對(duì)，ii)各持家基因的至少一個(gè)寡核苷酸引物對(duì)，iii)各靶基因的至少一個(gè)突變的競(jìng)爭(zhēng)性模板，iv)各持家基因的至少一個(gè)突變的競(jìng)爭(zhēng)性模板，及v)含有各靶基因cDNA的至少一個(gè)拷貝，和各持家基因cDNA的至少一個(gè)拷貝的天然cDNA；經(jīng)擴(kuò)增以形成聚合酶鏈反應(yīng)cDNA產(chǎn)物，其中含有：各靶基因與各持家基因的天然cDNA，和各靶基因與各持家基因的突變的cDNA；PCR反應(yīng)混合物中含有適量的不同靶基因的競(jìng)爭(zhēng)性模板混合物各競(jìng)爭(zhēng)性模板之間的濃度已知，還含有相對(duì)于靶基因定量的不同的持家基因，從而使被評(píng)估的靶基因與持家基因的天然和競(jìng)爭(zhēng)性模板通過(guò)下列擴(kuò)增而測(cè)得，方法是：i)制備足夠的含有cDNA等份、競(jìng)爭(zhēng)性模板混合物、各種dNTP、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和相應(yīng)于待測(cè)基因數(shù)目的緩沖液的母混合物；ii)將反應(yīng)混合物的等分樣品加入到置于冰上的反應(yīng)容器中，反應(yīng)容器的數(shù)目相應(yīng)于待測(cè)基因的數(shù)目，和iii)將待測(cè)基因的特異性引物的等分樣品加入到各反應(yīng)容器中，并將持家基因的引物加入一個(gè)單獨(dú)的管中，(b)分離cDNA產(chǎn)物；(c)通過(guò)將編碼各靶基因的天然cDNA的量和編碼靶基因競(jìng)爭(zhēng)性模板的突變的cDNA的量，與編碼各持家基因的天然cDNA的量和編碼持家基因競(jìng)爭(zhēng)性模板的突變的cDNA的量相比較，檢測(cè)天然cDNA產(chǎn)物和突變cDNA產(chǎn)物的相關(guān)存在量，其中比較靶基因與持家基因的天然cDNA產(chǎn)物和突變cDNA產(chǎn)物的量的相關(guān)存在量，提供了定量測(cè)定靶基因表達(dá)的方法；以及，(d)測(cè)定相應(yīng)于天然基因的PCR產(chǎn)物的譜帶密度與相應(yīng)于各基因的競(jìng)爭(zhēng)性模板的PCR產(chǎn)物的譜帶密度之比；其中，對(duì)于各個(gè)基因，將靶基因的天然/競(jìng)爭(zhēng)性模板的密度比除以持家基因的天然/競(jìng)爭(zhēng)性模板的密度比，得到單位為mRNA/106β-肌動(dòng)蛋白mRNA的最終值。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)復(fù)合競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)定量測(cè)定基因表達(dá)的方法及儀器。該方法和儀器特別適用于細(xì)胞和組織的小樣品分析。 |
| 國(guó)際公布 | WO1998/058083 英 1998.12.23 |
