公開(公告)號(hào)
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CN1462803A
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公開(公告)日
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2003.12.24
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN03134254.X
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申請(qǐng)日期
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2003.06.05
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專利名稱
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哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝
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主分類號(hào)
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C12N15/85
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分類號(hào)
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C12N15/85;C12N15/11;C12N15/70;C12N5/00;C12Q1/68;C12P21/02
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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劉軍;郭穎;薛采芳
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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劉軍;郭穎;薛采芳
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地址
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710032陜西省西安市長(zhǎng)樂西路17號(hào)第四軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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西安通大專利代理有限責(zé)任公司
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代理人
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徐文權(quán)
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國(guó)省代碼
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陜西;61
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主權(quán)項(xiàng)
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一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝,其特征在于:1)根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物:5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′;反向引物:5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′;正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn);2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞在800-1000rpm轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘,收集2×106-5×106個(gè)細(xì)胞;以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸收集的細(xì)胞,再依次加入20μL的蛋白酶K和200μL的DNeasyTM Tissue Kit緩沖液AL,震蕩混勻,在70℃下放置10分鐘,再加入200μL濃度為96%-100%的乙醇,震蕩混勻后,加入到DNeasyTM Tissue Kit離心柱中,在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘后,再次加入500μL的DNeasyTM Tissue Kit緩沖液AW1,以8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘,加入500μL的DNeasyTM Tissue Kit緩沖液AW2,在13000-14000rpm轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘,將DNeasyTM Tissue Kit離心柱放到一個(gè)干凈的1.5mL-2mL的離心管中,加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE,室溫下放置1-3分鐘,在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘,再向DNeasyTM Tissue Kit離心柱中加入200μL的DNeasyTM TissueKit緩沖液AE,室溫下放置1-3分鐘,在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘,得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA;在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水,在94℃延伸5分鐘后,于94℃延伸30秒、55-65℃延伸30秒、再于72℃延伸1-10分鐘,共循環(huán)25-40次,然后在72℃延伸7-10分鐘,得到PCR產(chǎn)物;3)哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收,純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后,與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株,以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒,用Xba I和Kpn I酶切鑒定,挑選酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒測(cè)序,序列測(cè)定采用雙脫氧鏈末端終止法,以ABI377DNA自動(dòng)序列測(cè)定儀進(jìn)行,構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。
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摘要
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哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝,根據(jù)人源性U6啟動(dòng)子的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),以HepG2細(xì)胞的基因組DNA為模板擴(kuò)增目的基因得到PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和KpnI酶切后,與同樣經(jīng)XbaI和KpnI酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株,以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒,用XbaI和KpnI酶切鑒定,挑選酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒測(cè)序,序列測(cè)定采用雙脫氧鏈末端終止法,構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體pUC18U6,本載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾核糖核酸,抑制相應(yīng)基因的表達(dá),從而可以用于研究相應(yīng)基因的功能;抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表達(dá),則可用于治療病毒性疾病和腫瘤等疾病。
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國(guó)際公布
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