| 公開(公告)號 | CN101003794A |
| 公開(公告)日 | 2007.07.25 |
| 申請(專利)號 | CN200710008447.3 |
| 申請日期 | 2007.01.11 |
| 專利名稱 | 人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用 |
| 主分類號 | C12N7/01(2006.01)I |
| 分類號 | C12N7/01(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A61K35/76(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P9/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 廈門大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 呂文清 |
| 地址 | 361005福建省廈門市思明南路422號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 陳永秀;馬應(yīng)森 |
| 國省代碼 | 福建;35 |
| 主權(quán)項 | 人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于所說的構(gòu)建方法如下： 步驟1、質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 1)pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)以從胎盤提取的組織總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成PEX cDNA第一條鏈； (2)根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和載體pGEX-4T-3的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計二個PCR引物，上游引物PEX446S，序列為5’-CTG AAT TCC TCT CCT GACATT GAC CTT G-3’，帶限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)；下游引物PEX660A，序列為5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn)； (3)以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條鏈為模板，利用PCR技術(shù)，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即長度為676bp的PEX cDNA片段，并重組入載體pGEX-4T-3中，得編碼人MMP2從446aa到660aa的PEX片段PEX215； (4)將PEX215重組于GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-3，獲得序列正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/PEX215； 2)PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2 C端片段PEX cDNA 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列為5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，帶限制性內(nèi)切酶Sfi I酶切位點(diǎn)；下游引物PEX660antisense，序列為5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’，帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn)；以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板，用引物PEX466sense與PEX660antisense一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，編碼人MMP2從466aa到660aa的PEX蛋白； 3)真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的PEX cDNA片段和載體pSecTag A經(jīng)Sfi I和XhoI雙酶切后，經(jīng)連接酶連接后構(gòu)建質(zhì)粒pSecTag A/PEX，該質(zhì)粒表達(dá)的PEX蛋白N端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈，C端帶有Myc表位標(biāo)簽，lg κ-鏈前導(dǎo)肽可介導(dǎo)PEX分泌到胞外，Myc表位檢測標(biāo)簽可用于外源性PEX蛋白的檢測以區(qū)別于內(nèi)源性PEX蛋白； 步驟2：腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-PEX的構(gòu)建 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其閱讀框架、pShuttle-CMV載體多克隆位點(diǎn)以及編碼框架，設(shè)計二條PCR反應(yīng)引物，其中上游引物PEX466leader序列為5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’，帶完整Kozak翻譯起始序列和限制性內(nèi)切酶NotI酶切位點(diǎn)，下游引物PEX660Myc序列為5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’，末端帶限制性內(nèi)切酶Hind III酶切位點(diǎn)和終止密碼子TGA；以步驟1構(gòu)建的質(zhì)粒pSecTag A/PEX為模板，利用PCR技術(shù)，用上游引物PEX466leader和下游引物PEX660Myc擴(kuò)增人MMP2 cDNA1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，編碼人MMP2從466aa到660aa的195aaPEX片段，并在表達(dá)的PEX N-端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈METDTLLLWVLLLWVPGSTGD，C-端帶有Myc表位EQKLISEEDLN檢測標(biāo)簽，將PCR擴(kuò)增得到的插入片段重組入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，構(gòu)建pShuttle-CMV-PEX質(zhì)粒； 步驟3：大腸桿菌中腺病毒的同源重組 將質(zhì)粒pShuttle-CMV-PEX用Pme I酶切線性化和磷酸化酶處理后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，二者同源重組生成腺病毒pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX； 步驟4：陽性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重組子的擴(kuò)增 將確定陽性重組子的病毒載體pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B擴(kuò)增，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，該病毒能在細(xì)胞中表達(dá)N-端帶Ig κ-鏈前導(dǎo)肽、C-端帶Myc表位標(biāo)簽的PEX蛋白，Ig κ-鏈前導(dǎo)肽可誘導(dǎo)PEX分泌到胞外，Myc表位檢測標(biāo)簽可用于外源性目的蛋白的檢測以區(qū)別于腫瘤內(nèi)源性PEX； 步驟5：重組腺病毒Ad-PEX在HEK293細(xì)胞包裝成完整的腺病毒 將重組腺病毒酶切線性化后轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞包裝成完整的腺病毒。 |
| 摘要 | 人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用，涉及一種人PEX外泌型重組腺病毒構(gòu)建方法。提供一種帶Myc標(biāo)簽的人PEX外泌型重組腺病毒構(gòu)建方法，步驟為質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建：pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建；PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2 C端片段PEX cDNA；真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建。腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-PEX的構(gòu)建。大腸桿菌中腺病毒的同源重組。陽性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重組子的擴(kuò)增。重組腺病毒Ad-PEX在HEK293細(xì)胞包裝成完整的腺病毒�？捎糜谥委熌[瘤等血管生成相關(guān)疾病的基因治療藥物。 |
| 國際公布 |
