公開(kāi)(公告)號(hào)
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CN101003794A
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公開(kāi)(公告)日
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2007.07.25
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200710008447.3
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申請(qǐng)日期
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2007.01.11
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專利名稱
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人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用
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主分類(lèi)號(hào)
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C12N7/01(2006.01)I
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分類(lèi)號(hào)
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C12N7/01(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A61K35/76(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I;A61P9/00(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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廈門(mén)大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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呂文清
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地址
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361005福建省廈門(mén)市思明南路422號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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廈門(mén)南強(qiáng)之路專利事務(wù)所
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代理人
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陳永秀;馬應(yīng)森
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國(guó)省代碼
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福建;35
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主權(quán)項(xiàng)
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人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法,其特征在于所說(shuō)的構(gòu)建方法如下: 步驟1、質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 1)pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)以從胎盤(pán)提取的組織總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成PEX cDNA第一條鏈; (2)根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)和載體pGEX-4T-3的多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)二個(gè)PCR引物,上游引物PEX446S,序列為5’-CTG AAT TCC TCT CCT GACATT GAC CTT G-3’,帶限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn);下游引物PEX660A,序列為5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’,帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn); (3)以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條鏈為模板,利用PCR技術(shù),用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1629bp~2304bp片段,即長(zhǎng)度為676bp的PEX cDNA片段,并重組入載體pGEX-4T-3中,得編碼人MMP2從446aa到660aa的PEX片段PEX215; (4)將PEX215重組于GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-3,獲得序列正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/PEX215; 2)PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2 C端片段PEX cDNA 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense,其中上游引物PEX466sense,序列為5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’,帶限制性內(nèi)切酶Sfi I酶切位點(diǎn);下游引物PEX660antisense,序列為5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’,帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn);以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板,用引物PEX466sense與PEX660antisense一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1685bp~2269bp片段,即585bp的PEX cDNA片段,編碼人MMP2從466aa到660aa的PEX蛋白; 3)真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的PEX cDNA片段和載體pSecTag A經(jīng)Sfi I和XhoI雙酶切后,經(jīng)連接酶連接后構(gòu)建質(zhì)粒pSecTag A/PEX,該質(zhì)粒表達(dá)的PEX蛋白N端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈,C端帶有Myc表位標(biāo)簽,lg κ-鏈前導(dǎo)肽可介導(dǎo)PEX分泌到胞外,Myc表位檢測(cè)標(biāo)簽可用于外源性PEX蛋白的檢測(cè)以區(qū)別于內(nèi)源性PEX蛋白; 步驟2:腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-PEX的構(gòu)建 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)及其閱讀框架、pShuttle-CMV載體多克隆位點(diǎn)以及編碼框架,設(shè)計(jì)二條PCR反應(yīng)引物,其中上游引物PEX466leader序列為5’-GATCAGCGGCCGCCCACCATGGAGACAG-3’,帶完整Kozak翻譯起始序列和限制性內(nèi)切酶NotI酶切位點(diǎn),下游引物PEX660Myc序列為5’-GTGCAAGCTTCAGCTATTCAGATCCTC-3’,末端帶限制性內(nèi)切酶Hind III酶切位點(diǎn)和終止密碼子TGA;以步驟1構(gòu)建的質(zhì)粒pSecTag A/PEX為模板,利用PCR技術(shù),用上游引物PEX466leader和下游引物PEX660Myc擴(kuò)增人MMP2 cDNA1685bp~2269bp片段,即585bp的PEX cDNA片段,編碼人MMP2從466aa到660aa的195aaPEX片段,并在表達(dá)的PEX N-端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈METDTLLLWVLLLWVPGSTGD,C-端帶有Myc表位EQKLISEEDLN檢測(cè)標(biāo)簽,將PCR擴(kuò)增得到的插入片段重組入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV,構(gòu)建pShuttle-CMV-PEX質(zhì)粒; 步驟3:大腸桿菌中腺病毒的同源重組 將質(zhì)粒pShuttle-CMV-PEX用Pme I酶切線性化和磷酸化酶處理后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183,二者同源重組生成腺病毒pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX; 步驟4:陽(yáng)性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重組子的擴(kuò)增 將確定陽(yáng)性重組子的病毒載體pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B擴(kuò)增,擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,該病毒能在細(xì)胞中表達(dá)N-端帶Ig κ-鏈前導(dǎo)肽、C-端帶Myc表位標(biāo)簽的PEX蛋白,Ig κ-鏈前導(dǎo)肽可誘導(dǎo)PEX分泌到胞外,Myc表位檢測(cè)標(biāo)簽可用于外源性目的蛋白的檢測(cè)以區(qū)別于腫瘤內(nèi)源性PEX; 步驟5:重組腺病毒Ad-PEX在HEK293細(xì)胞包裝成完整的腺病毒 將重組腺病毒酶切線性化后轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞包裝成完整的腺病毒。
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摘要
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人PEX外泌型重組腺病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用,涉及一種人PEX外泌型重組腺病毒構(gòu)建方法。提供一種帶Myc標(biāo)簽的人PEX外泌型重組腺病毒構(gòu)建方法,步驟為質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建:pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建;PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2 C端片段PEX cDNA;真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建。腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-PEX的構(gòu)建。大腸桿菌中腺病毒的同源重組。陽(yáng)性pAdEasy-pShuttle-CMV-PEX(Ad-PEX)重組子的擴(kuò)增。重組腺病毒Ad-PEX在HEK293細(xì)胞包裝成完整的腺病毒。可用于治療腫瘤等血管生成相關(guān)疾病的基因治療藥物。
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國(guó)際公布
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