小鵝瘟的確診方法有哪些?
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實(shí)驗(yàn)室診斷小鵝瘟的診斷是根據(jù)
流行病學(xué)、臨診癥狀和病理變化進(jìn)行的。1--3周齡的雛鵝群大批發(fā)病死亡，發(fā)病率和病死率極高，而青年鵝、成年鵝和其他家禽均未發(fā)生；患病雛鵝以排黃白色或黃綠色水樣稀糞為主要特征，腸管內(nèi)有條狀的脫落假膜或在小腸末端發(fā)牛特有的栓子阻塞于腸管。但要做出明確的診斷結(jié)論，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病毒分離鑒定以及血清學(xué)診斷。(1)病原分離及鑒定①病毒分離。病料及處理：無(wú)菌手續(xù)取患病雛鵝、死亡雛鵝的肝、胰、脾、腎和腦等內(nèi)臟器官病料，放置滅菌的玻瓶?jī)鼋Y(jié)保存作病毒分離用。方法一：先將病料組織剪碎、磨細(xì)，用滅菌生理鹽水，或滅菌PBS液作1：5～l：10稀釋，經(jīng)3 000轉(zhuǎn)／分，離心30分鐘，取上清液加入抗生素，使之每毫升組織液含有
青霉素、
鏈霉素各1 000單位，于37℃溫箱作用30分鐘，經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)為陰性者作病毒分離材料。方法二：將上述離心的上清液，經(jīng)0.22微米濾膜過(guò)濾除菌的組織液加入抗生素，使之每毫升含有青霉素、鏈霉素各500單位，經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)為陰性者作為病毒分離材料。方法三：將上述離心的上清液，按4：l加入分析純氯仿充分混勻后放置37℃溫箱作用60分鐘或4℃冰箱過(guò)夜，經(jīng)3 000轉(zhuǎn)／分，離心30分鐘，取上清液加入抗生素，使之每毫升含有青霉素、鏈霉素各1 000單位，于37℃溫箱作用30分鐘，經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)為陰性者作為病毒分離材料。胚胎接種（鵝胚或番鴨胚)：將上述病毒分離材料接種6枚12日齡易感鵝胚，每胚絨尿腔接種0.2毫升，置37～38℃孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵化，每天照胚2～4次，觀察9天，一般經(jīng)5～9天大部分胚胎死亡。在72小時(shí)以前死亡的胚胎廢棄，72小時(shí)以后死亡的鵝胚取出，放置4～8℃冰箱內(nèi)冷卻收縮血管。用無(wú)菌手續(xù)吸取絨尿液保存和做無(wú)菌檢驗(yàn)，并觀察胚胎病變。無(wú)菌的絨尿液凍結(jié)保存作傳代和檢驗(yàn)用。胚胎病變：由本病毒致死的鵝胚和番鴨胚具有相同的大體肉眼病變。絨尿膜增厚，全身皮膚充血，翅尖、趾、胸部毛孔、頸、喙旁均有較嚴(yán)重出血點(diǎn)，胚肝充血及邊緣出血，心臟和后
腦出血，頭部皮下及兩肋皮下
水腫。接種后7天以上死亡的鵝胚和番鴨胚胚體發(fā)育停頓，胚體小。②病毒鑒定。用鵝胚絨尿液分離病毒與已知抗小鵝瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)血清，或抗小鵝瘟病毒單克隆抗體用易感鵝胚做中和試驗(yàn)，或用易感雛鵝做中和試驗(yàn)；用已知抗小鵝瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)血清用易感雛鵝做保護(hù)試驗(yàn)；也可應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA、熒光抗體等方法鑒定病毒。 (2)病原與抗體檢測(cè)①瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。a．材料準(zhǔn)備。標(biāo)準(zhǔn)抗血清：標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、抗小鵝瘟病毒單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，均由指定單位提供。標(biāo)準(zhǔn)抗原：標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，由指定單位提供。被檢血清：無(wú)菌手續(xù)采集血液，分離血清，按0.01%量加入硫柳汞防腐，凍結(jié)保存待檢。被檢瓊擴(kuò)抗原制備：將分離毒株鵝胚絨尿液，經(jīng)3000轉(zhuǎn)／分，離心30分鐘，取上清液加入等量三氯甲烷（氯仿)振搖30分鐘后，經(jīng)3000轉(zhuǎn)／分，離心30分鐘。吸取上清液裝入透析袋，置于有干燥硅膠的密閉玻璃缸（或玻璃瓶)內(nèi)數(shù)小時(shí)，或至完全干燥為止，也可置40%聚乙二醇中濃縮（約12小時(shí))。加適量滅菌無(wú)離子水于透析袋內(nèi)，使之達(dá)到1/40～1/50原絨尿液量，待完全溶解后吸出置無(wú)菌小瓶?jī)?nèi)加入0.01%硫柳汞防腐，凍結(jié)保存，即為被檢瓊擴(kuò)抗原。瓊脂板制備：取1.0克優(yōu)質(zhì)瓊脂或瓊脂粉加100毫升、pH7.8的8%
氯化鈉溶液，加熱使其完全溶解后加入1毫升1%的硫柳汞溶液，混勻制成3毫米厚的平板，待冷卻后打孔即成。b．操作方法。檢測(cè)抗體：打孔：將制備好的瓊脂板按模板用打孔器打孔，并挑出孔中的瓊脂。中心1孔，周圍6孔，孔徑3毫米，孔距4毫米，用溶化瓊脂補(bǔ)孔底。加樣：中央孔加入標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，1孔、4孔加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，其他孔分別加入被檢血清，或1孔加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，其他孔分別加入被檢倍增稀釋血清，各孔均以加滿而不溢出為度。將加樣后的瓊脂板放入填有濕紗布的盒內(nèi)，置20～25℃室溫或37℃溫箱，經(jīng)24小時(shí)初判，72小時(shí)終判。結(jié)果判定：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之問形成清晰沉淀線時(shí)，被檢血清孔與抗原孔之間也出現(xiàn)沉淀線，且與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清沉淀線末端相吻合，即將被檢血清判為陽(yáng)性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間形成清晰沉淀線時(shí)，當(dāng)被檢血清孔與抗原孔之間無(wú)沉淀線出現(xiàn)時(shí)，即將被檢血清判為陰性。當(dāng)被檢血清最高稀釋度孔與抗原孔之問形成清晰沉淀線時(shí)，即判為被檢血清瓊擴(kuò)效價(jià)。檢測(cè)抗原： 打孔：同操作方法。加樣：中央孔加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性瓊擴(kuò)血清，l孔、4孔加入標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，其他孔加入被檢抗原。各孔均以加滿而不溢出為度。將加樣后的瓊脂板放人填入濕紗布的盒內(nèi)，置20～25℃室溫或37℃溫箱，經(jīng)24小時(shí)初判，72小時(shí)終判。結(jié)果判定：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)抗原孔與陽(yáng)性血清孔之間形成清晰沉淀時(shí)，被檢抗原孔與陽(yáng)性血清-之問也出現(xiàn)沉淀線，且與標(biāo)準(zhǔn)抗原沉淀線末端相吻合，即將被檢抗原判為陽(yáng)性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)抗原孔與陽(yáng)性血清孔之間形成清晰沉淀時(shí)，被檢抗原孔與陽(yáng)性血清孔之問無(wú)沉淀線出現(xiàn)時(shí)，即將被檢抗原判為陰性。②中和試驗(yàn)（鵝胚中和試驗(yàn))。a．材料準(zhǔn)備。標(biāo)準(zhǔn)抗血清：標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、抗小鵝瘟病毒單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均由指定單位提供。標(biāo)準(zhǔn)毒株：標(biāo)準(zhǔn)小鵝瘟病毒株（SYC61株)，由指定單位提供。被檢毒株：為鵝胚分離絨尿液毒，并進(jìn)行毒價(jià)滴定。被檢血清：無(wú)菌手續(xù)采集血液，分離血清，經(jīng)56℃30分鐘滅活，- 20℃保存?zhèn)溆�。稀釋液：可采用滅菌Hank's液或滅菌生理鹽水。b．病毒毒價(jià)滴定：先將小鵝瘟鵝胚絨尿液毒用每毫升含有青霉素和鏈霉素各1 000單位滅菌稀釋液做10倍系列稀釋，從10-1～10-8，每個(gè)稀釋度接種6枚12日齡易感鵝胚，每胚絨尿腔0.2毫升，置37-38℃孵化箱繼續(xù)孵化，觀察9天。每天照蛋2～4次，剔除接種后72小時(shí)內(nèi)死亡鵝胚，結(jié)果按Karber公式計(jì)算鵝胚半數(shù)致死量(ELD50)。小鵝瘟鵝胚適應(yīng)毒ELD50為l0 7.0左右。c．操作方法：固定病毒稀釋血清法：先將小鵝瘟胚絨尿液毒用滅菌稀釋液稀釋，使每一單位劑量含有200ELD50，與等量遞增稀釋的血清混合，置37℃溫箱作用60分鐘。每個(gè)稀釋度接種6枚12日齡易感鵝胚，每胚絨尿腔0.2毫升。同時(shí)設(shè)lOOELD50病毒液對(duì)照，置37-38℃孵化箱繼續(xù)孵化，觀察9天，記錄每組鵝胚的存活數(shù)。結(jié)果判定：1：8以上判為陽(yáng)性，1：2以下判為陰性，1:4為疑似反應(yīng)。固定血清稀釋病毒法：先將小鵝瘟胚絨尿液毒用滅菌稀釋液做10倍遞增系列稀釋，分裝到兩列滅菌試管中。第一列分別加等量陰性血清混合作為對(duì)照組，第二列分別加等量被檢血清混合，置37℃溫箱作用1小時(shí)。每個(gè)稀釋度接種6枚12日齡易感鵝胚，每胚絨尿腔0.2毫升。置37～38℃孵化箱繼續(xù)孵化，觀察8天，記錄每組鵝胚的存活數(shù)，計(jì)算ELD50和中和指數(shù)。結(jié)果判定：中和指數(shù)為對(duì)照組與被檢組ELD50的差數(shù)的反對(duì)數(shù)。中和指數(shù)<10為陰性，10～49為可疑，50以上為陽(yáng)性。③保護(hù)試驗(yàn)。用已知抗小鵝瘟血清注射易感雛鵝，然后用待檢病毒攻擊，或用被檢血清注射易感雛鵝，然后用已知小鵝瘟強(qiáng)毒攻擊，根據(jù)被保護(hù)的情況確定被檢病毒。5～10只5日齡左右的易感雛鵝或易感雛番鴨，每只雛禽皮下注射0.5毫升抗小鵝瘟血清或康復(fù)血清。血清注射后6～12小時(shí)分別注射含有1 000單位青霉素、鏈霉素的Hank's液或用生理鹽水稀釋的病毒，每雛100LD50劑量。前者用被檢的鵝胚強(qiáng)毒，或肝臟病料；后者用已知小鵝瘟鵝胚強(qiáng)毒，觀察10天，記錄雛鵝死亡數(shù)及檢驗(yàn)病變。試驗(yàn)時(shí)加設(shè)100LD50組和正常飼養(yǎng)對(duì)照組，每組均應(yīng)嚴(yán)格分開飼養(yǎng)，防止相互感染造成試驗(yàn)失敗。④瓊脂擴(kuò)散抑制試驗(yàn)。瓊擴(kuò)抗原加入相應(yīng)抗體，則抗原和抗體相結(jié)合而抑制沉淀帶的出現(xiàn)。如加入抗體過(guò)多，抗原和抗體結(jié)合后還有過(guò)�？贵w，又可與抗原相結(jié)合出現(xiàn)沉淀帶。此法可檢測(cè)抗原成分、鑒定沉淀帶性質(zhì)以及抗原抗體結(jié)合的最適比例。被檢血清和已知抗小鵝瘟血清分別用無(wú)菌PBS液做倍增稀釋，并將其各分為4份。其中2份分別加入等量已知小鵝瘟瓊擴(kuò)抗原和被檢瓊擴(kuò)抗原，另2份分別加入等量PBS液代替抗原，混勻后于37攝氏度溫箱作用1小時(shí)。按瓊擴(kuò)試驗(yàn)診斷方法進(jìn)行試驗(yàn)。
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實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
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通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診
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