一、血管壁細(xì)胞提取
1．以無(wú)菌術(shù)取動(dòng)脈，立即放入4℃、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗，除去凝血。
2．用小鑷剔除外膜纖維、脂肪組織，用剪子沿血管壁縱向剪開血管，用Hanks液洗2次。
3．可先分開內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，也可不區(qū)分兩類細(xì)胞，將血管切成小塊，放入2%膠原酶，溫浴12～18h。
4．梯度液選擇40%～70%，40%梯度液應(yīng)是4份precoll、1份小牛血清、5份BPS，其他濃度配制與此相同。
5.把密度梯度液按從管底至管口密度梯度逐漸減少的順序鋪入試管，將操作3.細(xì)胞液鋪于頂層，4kr/min離心，收集各層細(xì)胞鑒定。
二、細(xì)胞核提取
1．取制備血管細(xì)胞懸液放于試管中，加五倍體積緩沖液（10mmol/l Trisbhskgw.cn/yishi/HCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2)，加1%SDS10 μl用勻漿器輕輕勻漿。
2． 加蔗糖液（0.34mol/L,蔗糖10mol/LMgCl2)2份再勻漿1次，下面鋪一層0.88mol/L蔗糖，800g離心5min，收集沉淀部分。
3．在0.88mol/L蔗糖液中再純化1次，然后將細(xì)胞懸于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中，用超聲波處理10S。
4．將兩倍體積的0.88mol/L蔗糖加于上述處理液中，800g離心30min收集沉淀部分。
5．將沉淀加入0.88mol/L蔗糖，5kg離心1h，沉淀部分為細(xì)胞核，將其保存于0.25mol/L蔗糖，0.55mmol/LMgCl中備用。
三、細(xì)胞膜的提取
1．取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓，以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。
2．用Potter-Elvehiem勻漿器，桿與壁間間隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4～6次，每次5S。
3．過濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介質(zhì)，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。
4．合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于100μl介質(zhì)，離心10min，棄上清，留沉淀。
5．將沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個(gè)離心管中，上面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg離心90min，分離介質(zhì)在1.16～1.18之間形成介面。
7．收集d為1.16～1.18g/ml之間的細(xì)胞膜，加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min，洗滌2次。
8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中，用于細(xì)胞膜的研究分析。
四、溶酶體的分離
1．在梯度混合器的兩個(gè)小杯中分別加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖（比例9：1)。
2．收集血管壁細(xì)胞，用特制勻漿器1kr/min勻漿10次。
3．以150g離心10min，上清液以同樣條件離心1次，棄沉淀，上清液以9kg離心3min棄上清液，
4．沉淀分三種不同顏色，褐色為半純化的溶酶體，中間黃褐色為線粒體部分，上層白色為膜成分混合物。首先小心吸取上層，然后加入0.3mol/L蔗糖數(shù)毫升，慢慢搖勻使界面層懸浮，再用0.3mol/L蔗糖洗1次。
5．將懸浮的半純化溶酶體鋪在梯度平面上，用玻棒攪勻最上層梯度液，使溶酶體和梯度液之間的介面破壞，然后以10kg離心15min，離心后可出現(xiàn)三條明顯的區(qū)帶及少許沉淀，最下面黃褐色為純化的溶酶體，中間黃色的為線粒體。
五、線粒體的分離
1．漿分離的血管浸入緩沖液（250mmol/L甘露醇、0.5mbhskgw.cn/sanji/mol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4)勻漿破碎細(xì)胞，600g離心5min，除去細(xì)胞核及碎片。
2．上清液在100kg離心10min，留取沉淀部分。
3．將沉淀部分懸浮于5ml操作1.的緩沖液中，加入5倍體積30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L，EDTA、25mmol/LHepes 0.1%BSA,5000g離心30min。
4．將上述沉淀溶于適量10mmol/L KH2PO4，pH7.4中，輕輕振蕩15min。
5．加入10ml蔗糖液緩沖液（32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl2、10mmol/L KH2PO4，pH7.4)振蕩15min。
6．用BransonB-12超聲波碎儀60～70W處理2次，每次15min，12kg離心10min。
7．將沉淀部分溶于10倍體積緩沖液中并鋪于試管底層，試管中層鋪成不連續(xù)蔗糖梯度（25.3%、37.9%和51.3%)蔗糖各4mm厚，上層鋪上清液。
8．2kg離心3h，在25.3%/37.9%界面處為線粒體外膜，在51.3%蔗糖層分別回收內(nèi)膜和基質(zhì)。
