免疫溶血反應(yīng)是補體參與的抗體致敏紅細胞的溶解反應(yīng)。參與反應(yīng)的成分有3種：①紅細胞，一般用綿羊紅細胞（SRBC)；②抗紅細胞抗體，也稱溶血素，多為家兔抗SRBC的抗血清；③補體。
溶血反應(yīng)的直接用途是測定總補體活性或溶血素的效價；也可利用溶血系統(tǒng)作為指示劑，檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)的抗原或抗體，即補體結(jié)合試驗。
（一)補體
檢測血清補體水平或補體活性時需要從受檢者采血及分離血清。做補體結(jié)合試驗時多采用豚鼠血清作為www.med126.com實驗用補體的來源。因為補體在體外極易衰變，所以檢測補體活性的血清標(biāo)本和作為補體試劑的血清必須新鮮。
受檢者一般做靜脈采血，在動物可做心臟采血。血清分離后應(yīng)及時使用，最好在當(dāng)日用完。必須保存時采用小量分裝的辦法，置－70℃下可保存數(shù)月，避免反復(fù)凍融。凍干制品可長期保存，但其活性都不同程度地比新鮮血清降低。
以豚鼠血清作補體來源時，應(yīng)考慮到個體差異。為了確保血清中補體的有效活性，必須取3只以上豚鼠的血清混合后使用。
（二)綿羊紅細胞
從綿羊頸靜脈無菌采血，抽出血液后立即小心地注入放有玻璃珠的無菌干燥三角燒瓶中，充分旋搖15～20min，以除去纖維蛋白。也可將羊血與等量或2倍量的Alsever血液保存液混合，既有抗凝作用，又適于儲存；分裝后置4℃，可使用3周。
實驗前，取適量抗凝血，加入8～10倍的生理鹽水，輕輕混勻后2000r/min離心5min；棄上清，沉淀的紅細胞用生理鹽水再洗一次，這時上清為無色澄清，如顯紅色說明有溶血現(xiàn)象，應(yīng)更換新鮮羊血；第三次用緩沖液洗滌，棄上清，取壓積紅細胞用緩沖液配制SRBC懸液，使用濃度一般為2％～5％。為使紅細胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化，可吸取少量紅細胞懸液，中入20～30倍的稀釋液中，在542nm波長比濁，以吸光度為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整紅細胞濃度。
（三)溶血素
溶血素即抗綿羊紅細胞抗體，多是以綿羊紅細胞免疫家兔而得到兔抗血清。一般沒有必要進一步提純抗體，但在試驗前需先進行加熱56℃30min或60℃3min以滅活補體。
由于補體溶血試驗及補體結(jié)合試驗均是比較精密的試驗，其結(jié)果與溶血素的效價有關(guān)，所以試驗需要滴定溶血素效價；在制備抗血清的過程中，于動物采血前和分離抗血清后也需要滴定溶血素效價。
1．溶血素稀釋稀釋溶血素時，要先對效價有個大概的估計，以便確定稀釋度的范圍。動物采血前滴定時稀釋范圍要稍大些，實驗前的滴定便以原先的記錄作為參考（溶血素的效價多在數(shù)千單位以上)。溶血素稀釋一般不采用連續(xù)倍比稀釋法，因為稀釋到最后時跨度太大，不容易確定單位。為了便于操作，現(xiàn)舉例按表14-1配制不同稀釋度的溶血素。
表14-1不同濃度溶血素的配制
| 最終稀釋度 | 緩沖液（ml) | 所加溶血素 | |
| 稀釋度 | 體積（ml) | ||
| 1:1000 | 1.8 | 1:100 | 0.2 |
| 1:2000 | 0.2 | 1:1000 | 0.2 |
| 1:3000 | 0.4 | 1:1000 | 0.2 |
| 1:4000 | 0.2 | 1:2000 | 0.2 |
| 1:5000 | 0.8 | 1:1000 | 0.2 |
| 1:6000 | 0.2 | 1:3000 | 0.2 |
| 1:8000 | 0.2 | 1:4000 | 0.2 |
| 1:10000 | 0.2 | 1:5000 | 0.2 |
2．效價滴定將稀釋好的溶血素及其他試劑按表14-2所示逐步加入到各試管中，放置37℃水浴，不要蓋上水浴箱的蓋子，以免蓋子上冷凝的水蒸氣滴入試管內(nèi)引起非補體性溶血。30min后取出觀察結(jié)果。
表14-2溶血素的滴定
| 管號 | 溶血素稀釋度 | 試管內(nèi)加的各種試劑材料 | 結(jié)果 | |||
| 溶血素(ml) | 1:60稀釋補體(ml) | 緩沖液(ml) | 20％羊紅細胞(ml) | |||
| 1 | 1:1000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 全溶 |
| 2 | 1:2000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 全溶 |
| 3 | 1:3000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 全溶 |
| 4 | 1:4000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.bhskgw.cn/wszg/1 | 全溶 |
| 5 | 1:5000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 大部分 |
| 6 | 1:6000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 微溶 |
| 7 | 1:8000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 不溶 |
| 8 | 1:10000 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 不溶 |
| 9 | (對照) | － | － | 0.5 | 0.1 | 不溶 |
溫育反應(yīng)后，完全溶血的試管內(nèi)液體紅色透明，放置一段時間后管底無細胞沉淀，離心后可見少許細胞碎渣。不溶血的管內(nèi)液體渾濁；放置后可見紅細胞沉淀，上清無色透明。不同程度的不完全溶血介于兩者的中間變化態(tài)。
按照以上標(biāo)準(zhǔn)，以產(chǎn)生完全溶血的最高稀釋管為最大有效反應(yīng)管，以該管的溶血素稀釋倍數(shù)為溶血素產(chǎn)效價。例如表14-2中的溶血素效價應(yīng)為1:4000；在1:4000稀釋的情況下，反應(yīng)液中所含溶血素的的量為1U/ml。
做補體活性測定或補體結(jié)合試驗時，一般使用2U/ml溶血素（在本例做1:2000稀釋)，與SRBC懸液等體積混合。
（四)稀釋緩沖液
磷酸緩沖液或巴比妥緩沖液等均可用于溶血試驗，pH值應(yīng)調(diào)至7.2～7.4之間。另加入適量氯化鈉以保持等滲，并適當(dāng)?shù)丶尤胍恍┾}離子和鎂離子，這是補體活化所不可缺少的。有的配方還加入0.1％的明膠以使蛋白溶液穩(wěn)定；加入0.01％NaN3可以防腐，利于較長時間保存。
（一)CH50試驗原理
補體最主要的活性是溶細胞作用，這種活性很容易通過溶血反應(yīng)進行檢測。在一個適當(dāng)?shù)�、穩(wěn)定的反應(yīng)系統(tǒng)中，溶血反應(yīng)對補體的劑量依賴呈一個特殊的S形曲線（圖14-1)。
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圖14-1溶血程度與補體含量的關(guān)系
從圖14-1可以看出，在輕微溶血和接近完全溶血時，補體量的變化不能使溶血程度有顯著改變，速溶血對補體量的變化不敏感。但在半溶血（50％溶血)上下時曲線最陡，即使補體含量僅有較小變動時，溶血程度也會發(fā)生較大的改變，也就是說對補體量的變化非常敏感。故采用50％溶血作為終點指標(biāo)要比100％溶血敏感得多，這一方法稱為補體50％溶血（complementhemolysis50％)，簡稱為CH50。
（二)CH50試驗方法
取新鮮血清標(biāo)本進行試驗。按表14-3的要求在各管中加入試劑和反應(yīng)物，一起放37℃水浴箱中溫育30min。
做CH50試驗時，應(yīng)同時配制50％溶血的標(biāo)準(zhǔn)管。取2％SRBC懸液0.5ml，加2.0蒸餾水，使SRBC全部溶解；再加入2.0ml1.8％NaC1溶液校正為等滲溶液；最后加入2％SRBC懸液0.5ml，即成為50％溶血狀態(tài)；混勻后取該懸液2.5ml，隨試管一起進行溫育，便是50％溶血標(biāo)準(zhǔn)管。
表14-3總補體溶血活性測定
| 試管號碼 | 1:20稀釋血清（ml) | 巴比妥緩沖液（ml) | 2U溶血素（ml) | 2％羊紅細胞（ml) |
| 1 | 0.10 | 1.40 | 0.5 | 0.5 |
| 2 | 0.15 | 1.35 | 0.5 | 0.5 |
| 3 | 0.20 | 1.30 | 0.5 | 0.5 |
| 4 | 0.25 | 1.25 | 0.5 | 0.5 |
| 5 | 0.30 | 1.20 | 0.5 | 0.5 |
| 6 | 0.35 | 1.15 | 0.5 | 0.5 |
| 7 | 0.40 | 1.10 | 0.5 | 0.5 |
| 8 | 0.45 | 1.05 | 0.5 | 0.5 |
| 9 | 0.50 | 1.00 | 0.5 | 0.5 |
| 10 | 0.00 | 1.50 | 0.5 | 0.5 |
溫育后將所有試管2500r/min離心5min，通過觀察比較，選擇溶血程度與標(biāo)準(zhǔn)管相近的兩管在分光光度計上分別讀取吸光度，以最接近標(biāo)準(zhǔn)管的那一管定為最高有效反應(yīng)管，取其稀釋倍數(shù)代入下列公式，求得CH50的測定值（單位U)。
每毫升血清總補體活性（單位)＝×稀釋倍數(shù)
用CH50法測定總補體溶血活性時，所測得的值與反應(yīng)體積成反比例關(guān)系，上例采用的液體總量為2.5ml，測得的總補體活性的參考范圍為50～100U/ml。
（三)臨床意義
CH50法主要檢測的是補體經(jīng)典途徑的溶血活性，所反映的主要是補體9種成分的綜合水平。如果測定值過低或者完全無活性，首先考慮補體缺陷，可分別檢測C4、C2、C3和C5等成分的血清含量；嚴(yán)重肝病時血漿蛋白合成能力受損，營養(yǎng)不良時蛋白合成原料不足，這些也都可以不同程度地引起血清補體水平下降。
在患系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎等自身免疫病時，血清補體水平隨病情發(fā)生變化。疾病活動期補體活化過度，血清補體水平下降；病情穩(wěn)定后補體水平又反應(yīng)性增高。另外，補體各成分在不同的自身免疫病時可有特征性的表現(xiàn)（詳見第二十五章)，因此補體檢測�？勺鳛樽陨砻庖卟≡\斷或是否有疾病活動的參考指標(biāo)。
細菌感染、特別是革蘭陰性細菌感染時，常因補體旁路途徑的活化過度引起血清補體水平降低。心肌梗塞、甲狀腺炎、大葉性肺炎、糖尿病、妊娠等情況下血清補體水平常升高。
