胃腸道與外界相通，其粘膜表面附著各種細(xì)菌和病毒。粘膜含有各種組織溶解酶，而且胃粘膜呈酸性，www.med126.com腸粘膜偏堿性，因此在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色過程中，必須注意以下幾個(gè)環(huán)節(jié) ：
免疫細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)就是檢查、鑒定、定位和示蹤組織中各種抗原成分。在組織加工過程中，必須保持抗原的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、抗原性和在組織中的位置保持不變，不引起組織產(chǎn)生自發(fā)熒光及其它非特異性著色。原則上越新鮮的組織越適于進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)研究。
1．組織切片標(biāo)本經(jīng)胃鏡、小腸鏡和大腸鏡等內(nèi)窺鏡取材可以在直視下根據(jù)研究的內(nèi)容在不同部位進(jìn)行取材，即準(zhǔn)確又方便。一般組織塊直徑多在0.5～1.0mm左右，適合進(jìn)行各種抗原的研究。
（1)取材方法：將取材部位調(diào)整到內(nèi)窺鏡視野中央，使活檢鉗與粘膜面垂直，然后鉗取。活檢鉗應(yīng)盡量下壓深取達(dá)粘膜全層。取出活檢鉗并打開活檢器時(shí)要輕，防止粘膜撕裂。立即將活檢組織輕輕在粘在濾紙上，并盡量使粘膜面與濾紙平行。
（2)組織固定：根據(jù)所查抗原的種類采取相應(yīng)的固定方法。我們的體會是：對某些蛋白類抗原，如免疫球蛋白、SC、CEA等一般用95%冷酒精固定較好。95%乙醇不但能固定蛋白抗原，而且保持與抗體的免疫反應(yīng)能力，同樣可以進(jìn)行HE染色。除組織有部分收縮外，組織成分和抗原位置沒有大的改變，組織塊可以在冰箱內(nèi)長期保存。我們對保存26個(gè)月的冷酒精固定組織進(jìn)行CEA和SC的研究，效果仍很好。對多肽類激素的研究可以用4%多聚甲醛緩沖淮，Bouin 緩沖液或福爾馬林緩沖液進(jìn)行固定，或直接液氮固定后冷凍切片。冷酒精固定的組織不宜進(jìn)行多肽類激素的研究。對陳舊性福爾馬林的固定的組織可以在抗原表面形成蛋白衣，直接影響抗原抗體反應(yīng)。有人用胰酶消化后暴露抗原部位，進(jìn)行胃泌素細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，也獲得較好結(jié)果。要進(jìn)行胃腸道多肽類神經(jīng)的免疫組化研究，可用含Triton的固定液和冰凍切片。對小白鼠等動物可向血管內(nèi)注射多聚甲醛等固定劑，然后處死取材。進(jìn)行細(xì)胞膜抗原的單克隆抗體研究時(shí)最好用Cryostat冰凍切片，然后丙酮或乙醇固定10min左右。
（3)組織加工：溫度對抗原抗體均有影響。一般在4℃進(jìn)行脫水和透明。包埋選用低熔點(diǎn)蠟（52℃～56℃)，浸蠟時(shí)間以20min左右為宜（因組織塊較小)。脫蠟和脫二甲苯也應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
（4)組織保存及切片：石蠟包埋或其它方法加工后最好立即進(jìn)行切片和免疫細(xì)胞化學(xué)染色。根據(jù)不同的抗原也可以在低溫下保存一段時(shí)間后再染色。組織切片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)際上使切面的抗原暴露后直接與抗體相結(jié)合，一般組織切片厚度以5～7μm為宜。如果觀察神經(jīng)纖維則以10～20μm為好。太厚則透射光不易通過，影響觀察，易出現(xiàn)自發(fā)熒光。如果進(jìn)行免疫電鏡觀察，最好超薄切片。
2．涂片或印片標(biāo)本拉網(wǎng)和內(nèi)窺鏡下獲得的胃腸道分泌物等可直接涂片，空氣干燥，再用乙醇固定后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。涂片和印片缺乏明確的組織結(jié)構(gòu)，標(biāo)本中常�；煊胁煌螒B(tài)的組織細(xì)胞和其它蛋白等無定形成份，很容易造成假陽性，觀察時(shí)應(yīng)當(dāng)特別注意。
3．組織分離細(xì)胞將手術(shù)或活檢組織塊用機(jī)械研磨或膠原酶消化等方面可分離出細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，在試管內(nèi)進(jìn)行活細(xì)胞免疫熒光或免疫酶等免疫細(xì)胞化學(xué)染色。流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量和定性分析。此法對細(xì)胞膜抗原的研究有較大價(jià)值。我們在試管內(nèi)用免疫熒光技術(shù)對周圍血分離的單核樣細(xì)胞進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群和B淋巴細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)OKT3、OKT4、OKT8和Ia的熒光均分布于細(xì)胞膜，隨著細(xì)胞的滾動，猶如火球，非常清晰。
示蹤抗原的抗體必須具有高度特異性，盡量減少非特異性染色和干擾。因此染色前必須測定抗體的工作效價(jià)，并用嚴(yán)格的陽性對照。組織切片應(yīng)當(dāng)有連續(xù)切片的HE染色作對照。
應(yīng)當(dāng)根據(jù)設(shè)備條件，具備的抗體和示蹤抗原的特點(diǎn)進(jìn)行選擇。我們的經(jīng)驗(yàn)是：因胞漿性抗原含量較多，可以用簡便和廉價(jià)的間接法甚至直接法免疫細(xì)胞化學(xué)染色；對膜抗原及其它一些微量抗原應(yīng)當(dāng)選用PAP或ABC法，如果同時(shí)進(jìn)行兩種以上抗原的檢查，最好進(jìn)行雙標(biāo)記和多標(biāo)記免疫細(xì)胞化學(xué)染色；為了顯示較弱的抗原，可以用對比染色技術(shù)，背景為另一種顏色，使陽性抗原著色更突出。
1．如研究胃粘膜中抗體產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)當(dāng)掌握在HE染色時(shí)的車輪狀核位于胞漿一側(cè)，胞漿特別豐富，染色時(shí)僅胞漿著色而核不著色等特點(diǎn)。同時(shí)應(yīng)了解所研究的抗原在組織中的大致定位及分布規(guī)律。如分泌5-羥色胺的內(nèi)分泌細(xì)胞多位于固有層間質(zhì)內(nèi)，VIP和SP分布在固有層神經(jīng)末梢及粘膜下層的神經(jīng)元，胃泌素細(xì)胞分布胃腸腺體細(xì)胞之間。CEA多分布在腺癌細(xì)胞，如果在固有層內(nèi)出現(xiàn)陽性細(xì)胞，要謹(jǐn)慎對待，必須排除污染、內(nèi)源酶或自發(fā)熒光，同時(shí)與連續(xù)切片的HE染色切片對比觀察才能作出判斷。
2．陽性結(jié)果的定量分析免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色受到的影響因素較多，最好在相同組織加工方面、統(tǒng)一批號抗血清和標(biāo)記抗體、統(tǒng)一染色技術(shù)和結(jié)果判定方法，同時(shí)對病態(tài)和正常組織進(jìn)行對照觀察才能增加可比性。用免疫組織化學(xué)進(jìn)行抗原定量分析時(shí)，可根據(jù)著色程度，選用某一基點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量計(jì)數(shù)，但容易受主觀因素的影響。近年來，數(shù)字減影技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了定量研究的準(zhǔn)確性。對陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)，多采取以下幾種方法：
（1)直接計(jì)數(shù)法：以10～20個(gè)隨意選擇的高倍視野直接進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，或計(jì)算100～200個(gè)總細(xì)胞中陽性細(xì)胞的數(shù)量。由于陽性細(xì)胞分布的不均勻性，可能存在一定誤差。
（2)體積計(jì)數(shù)法：測定單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，再算出每立方毫米體積內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)。一般組織切片只有5～7μm厚，與1mm厚度組織切片的細(xì)胞密度不可能完全一致。
（3)細(xì)胞密度計(jì)數(shù)法：即計(jì)算單位粘膜面積的陽性細(xì)胞數(shù)。有人提出以0.5mm寬，粘膜切面會層（約0.6mm)作為一個(gè)單位。因內(nèi)窺鏡取材時(shí)，組織塊不規(guī)則，顯微鏡下要具體選擇有一定困難，。我們用改良的Dellesses公式進(jìn)行計(jì)算比較方便。原公式NV=N（P∑r2)×109，NV代表每立方毫米體積細(xì)胞數(shù)；N代表細(xì)胞總數(shù)，r為測微器小方格邊長（μm)；∑為bhskgw.cn/hushi/切片厚度（μm)；P為小方格數(shù)。我們只計(jì)算每平方毫米面積細(xì)胞數(shù)，即D=N/（P∑r2)（r單位為mm)。方和邊長為0.5mm的測微器放在目鏡下，物鏡放大4倍，即用測微器去量放大4倍的物體，測出的邊長必須縮小4倍才是物體的真正面積，已知r為0.5mm，將上述數(shù)據(jù)代入公式，得D=N（r/4)2=16N/(Pr2)=16N/(P(0.5)2)=64N/P。只要計(jì)算整個(gè)組織切片的細(xì)胞數(shù)和所占小方格數(shù)，即可得出陽性細(xì)胞密度（細(xì)胞數(shù)/mm2)。組織分離細(xì)胞可通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。
