十余年來，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp)與各種慢性胃病（慢性胃炎，消化性潰瘍，胃癌等)之間的關(guān)系，基本上已取得了一致認識�？墒侨匀挥性S多問題有待解決。例如：Hp的致病及致癌機進、Hp感染的免疫預(yù)防治療問題；抗Hp治療方案及藥物的改進、是否所有Hp感染者都需要用抗Hp治療等。這些問題的解決除了靠臨床資料的累積外，免不了需要在實驗動物模型上作更深入的研究。然而，制備與Hp感染有關(guān)的慢性胃病的動物模型比較復(fù)雜、比較困難，因此尚未能普遍采用。問題在于Hp是一種人類胃部的寄生菌，它并不能在任何動物胃中定居。另一方面許多動物消化道中自然寄生著一些類似于Hp的細菌，這給在實驗動物中識別Hp與類似菌造成困難。下面我們來看一看已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Hp類似菌在自然動物中感染情況和已建立的Hp感染動物模型及其應(yīng)用的現(xiàn)狀。
1 Hp類似菌的自然感染
早在19世紀末有在狗、貓、棕色的挪威鼠胃中發(fā)現(xiàn)了螺形菌。但未在人、猴、牛、豬、小鼠、鴿子、烏鴉中找到。由于當(dāng)時僅憑形態(tài)學(xué)判斷，因此這些結(jié)果都未能肯定下來。直到1983年Marshall從人胃中分離到幽門彎曲菌（Campylobacter pylori,CP)后，才引起人們注意到此菌與慢性胃病的關(guān)系。同時亦引發(fā)人們對各種動物胃中類似菌的興趣。1989年Goodwin對CP作了深入研究后，認為CP不同于彎曲菌屬細菌，提出了一個新屬名螺桿菌（Helicobacter)，并確定Cp是這一屬中的代表菌種，稱作幽門螺桿菌（H.pylori, Hp),同時亦把從雪貂胃中分離到的類似菌H.mustelac(Hm)，包括在這一屬中，H屬最主要的特征是指這一類細菌屬革蘭陰性、螺旋形、有帶鞘的鞭毛。微需O2尿素酶（+)。有特殊的脂肪酸組成等。自此以后，人們從不同種類動物的消化道中發(fā)現(xiàn)了不下10余種H屬細菌。最早分離到的可能是大鼠和小鼠腸道中分離到的H.muridarum.已知有6種H菌從不同動物胃里分離到。除Hp與Hm外。尚有貓狗中的H.felis(HF)，卷尾猴中的H.nemetrinae，獵豹中的“H.acinonyx”和狗中的H.bizzozero。原來歸在Campylobacter屬里的與人類胃腸炎有關(guān)的類似菌，H.cinaedi、H.fennelliac和H.heilmanii亦已歸入此屬�！癋lexispira rappini”最早是在流產(chǎn)羔羊中分離到的細菌，最近亦在胃腸炎的病-人和小獵兔犬胃中發(fā)現(xiàn)。雖然這一細菌表現(xiàn)型上與Hp有差別，但根據(jù)產(chǎn)生尿素酶和基因型的特征已歸入此屬，稱作“h.rappini”。除此之外尚有一些在動物下消化道中發(fā)現(xiàn)的，例如，引起小鼠肝炎的H.hepaticus等。
在人類或動物胃中除了Hp類似的細菌外，還有一些緊密螺旋形的細菌。例如：人胃中的人胃螺菌“Gastrospirillum bominis”，由于它們尚未能分離培養(yǎng)，對它們的生物學(xué)性狀尚未充分了解，因此有的尚未正式命名。Henry就曾報告在小獵兔犬的胃粘膜電鏡下曾顯示三種形態(tài)的細菌：第一種是H.rappini，第二種H.felis，第三種是 “G.hominis”，用特探針發(fā)現(xiàn)三者有明顯的差別。還有一些未曾命名的H屬細菌已經(jīng)在燕鷗、家雀和豬中發(fā)現(xiàn)。有人還在雪貂中發(fā)現(xiàn)不同于Hm的H屬細菌。在這同時亦有人報道從猴類動物及貓中直接分離到Hp。由此可以想像研制Hp感染動物模型的復(fù)雜性。
2 Hp感染的動物模型
1983年后許多學(xué)者企圖在常規(guī)實驗室動物包括小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、無菌（Germ Free,GF)級無菌大鼠中用口服攻擊法建立Hp感染的動物模型，結(jié)果均未成功。1987年krakowka考慮到豬的雜食性及其胃的解剖結(jié)構(gòu)生理功能與人類相似，另一方面為了盡可能避免有可能干擾Hp感染成功的種種因素，他們成功地用GF級小豬口服接種Hp，建立了Hp感染的悉生（kontbiotic)動物模型。他們除了在此動物胃中重新分離到Hp外，亦觀察到了由Hp感染引起的類似于人類感染Hp后引起的疾病的特征。接著亦有人用無特種�。╯pecific-pathogen-free),SPF)級的小獵兔犬中用口服Hp，亦建立了悉生犬類動物模型。由于建立較大型動物的悉生動物模型條件較困難，較難于推廣應(yīng)用。有人企圖口服接種Hp于GF級的BALB/c小鼠和GF級的Sprague-Dowley大鼠建立動物模型，但未能成功。后來Lee用HF接種于GF級的Swiss Webster小鼠，2周內(nèi)出現(xiàn)了急性炎癥反應(yīng)，3周后轉(zhuǎn)為在人類感染Hp后出現(xiàn)的類似的慢性炎癥過程。由此，第一次在小動物中建立了類Hp感染的悉生動物模型。1992年Karita用BALB/c裸鼠口服接種Hp獲得成功。用這一裸鼠的動物模型，不僅能維持20周，而且能觀察到胃炎、十二指腸炎及所有感染動物中所能觀察到的一切病理學(xué)證據(jù)。雪貂是一種產(chǎn)于北美、北歐、與南太平洋地區(qū)的動物。它的胃的解剖生理學(xué)特征與人類相似，且飼養(yǎng)管理較方便，價格并不很貴。成年貂幾乎100%感染了HM（它的生物學(xué)特性與Hp近似)，且亦能引起胃炎、潰瘍等病變及相關(guān)的免疫反應(yīng)。因此，F(xiàn)ox推薦亦可把它用作替代Hp感染的動物模型。盡管前面已經(jīng)介紹了幾種不同類型的動物模型，但是迄今仍然可以說尚沒有能普遍被接受。因為由GF級動物制成的動物模型，不僅需要有昂貴的設(shè)備的設(shè)備條件、復(fù)雜的飼養(yǎng)管理、操作手段。因此用這類動物模型亦僅能解決某些特定條件下的問題。裸鼠也是一種有免疫缺陷的小動物，飼養(yǎng)管理當(dāng)然比GF級動物容易一些，但由于較小，實驗觀察亦有它有便的地方。而且它只對Hp的新鮮分離株敏感，對實驗室株不敏感。有Hm和Hf株建立的動物模型，盡管與Hp感染相似，但畢竟不是Hp，因此用這類細菌感染的實驗動物亦有它的局限性。Dubois等根據(jù)現(xiàn)有的文獻資料通過表現(xiàn)型與基因型分析從恒河猴胃中分離到Hp樣細菌與人類的Hp高度同源，因此觀察了26只族群繁殖的猴群的自然感染史，取胃粘膜活檢作病理切片及細菌分離培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)13只感染了Hp，9只感染了（G.hominis樣細菌，GHLO)，其中3只兼有兩種細菌。而4只未感染上述兩種細菌，未感染和只感染了GHLO的動物中胃炎的比數(shù)≤1:5，在所有感染了Hp的動物中胃炎的比數(shù)≥2.0。在13只Hp感染的動物中有12只具有相應(yīng)的IgG，13只Hp陰性的動物中僅有2只具有IgG比例≥0.5（P＜0.001)。在實驗觀察期間，一只猴子感染上了Hp，同時發(fā)生胃炎和血漿IgG水平的升高。在未感染的動物中，感染胃炎、血漿IgG水平保持7～15個月不變，在6個月時6只猴子用三聯(lián)療法根除了Hp，隨之降低了胃炎和血漿IgG的淺水水平。Dubols從他的實驗中認為隱匿Hp的恒河猴伴有持續(xù)的感染、胃炎及特異性抗體水平的升高。所有這些都對適當(dāng)?shù)闹委熥鞒龇磻?yīng)。而GHLO感染很少有炎癥相伴，因此提出自然感染Hp的恒河猴亦可作為人類Hp感染的動物模型。
3 動物模型的應(yīng)用
3.1 抗Hp療法療效研究 在前述Dublos用自然感染Hp的恒河猴做實驗。不僅證明了它可以用作Hp的動物模型，亦是用Hp感染動物模型研究抗Hp療法療效的典型例子。他在第一個試驗中用溶介在Tang溶液中的Amoxicillin+Metronidazole+Bismuth Subsalicylate給6只恒河猴、2只感染Hp，4只感染GHLO治療4周。在兩組中均未觀察到可以檢測到的變化。作者的結(jié)論認為這一療法對根除Hp毫無療效。在另一試驗中，同樣藥物對6只恒河猴每天胃內(nèi)給予2次，連續(xù)10d，在第5d和1個月時都已證明清除了細菌，2個月后有2只猴子又發(fā)現(xiàn)了Hp感染表明可能是復(fù)發(fā)或再感染。其他4支動物直到治療后6月仍然保持陰性，由此被認為，感染是被根除了。3個動物在治療前也有GHLO感染，治療5d后GHLO轉(zhuǎn)為陰性，但是，一個月后，3只動物重新發(fā)現(xiàn)GHLO感染的證據(jù)。在第3個月時，另一個動物也出現(xiàn)GHLO。直到第5和第6個月時，所有4個猴子雖然都清除了它們的Hp感染，但增保持了GHLO的感染。治療后一月胃炎程度比開始時下降，在4個根除Hp的恒河猴中的胃炎比≤1.0，而在2個復(fù)發(fā)Hp感染的動物中胃炎比恢復(fù)到＞2.0。經(jīng)過治療后在Hp根除的動物中血漿IgG比例逐漸下降。在2個未根除Hp的動物中保持不變。由此，它像在人類中一樣，根除Hp后，胃炎和免疫抗體逐漸消失了。
3.2 在研究Hp致病機理方面的應(yīng)用Eaton等用來自四窩23只悉生小豬以有動力和無動力的Hp株攻擊。發(fā)現(xiàn)動力最強的感染率最高，達100%，動力最弱的感染率最弱，僅有17%，動力居中間的感染率達40%，從悉生小豬分離的Hp，動力比攻擊株更強，攻擊株產(chǎn)生的細胞毒素亦不相同，動力最弱的株產(chǎn)生最小量的細胞毒素，而其他兩株均產(chǎn)生較高水平的細胞毒素，而其他兩株均產(chǎn)生較高水平的細胞毒素。由此，悉生小豬中Hp的毒力與動力相一致，而與細胞毒素的產(chǎn)生不完全一致。
Tsuda等從病人身上分離到的Hp野生株CPY3401，用一個耐卡那霉素的決定簇基因插入到其尿素酶的基因中，使其變成一個無尿素酶活性的Hp突變株Hp173。然后，用CPY3401與Hp173兩個同源株去攻擊裸鼠，企圖證明尿素酶的致病性。結(jié)果在CPY3401攻擊的胃出現(xiàn)了胃炎，且由此動物分離到的Hp與原來攻擊株地區(qū)別。而Hp173攻擊的動物不發(fā)生胃炎，而且不能分離到Hp在裸鼠胃中定居的重要因子。
3.3 在研究免疫反應(yīng)中的應(yīng)用 為了說明Hp尿素酶亞單位作為粘膜免疫原的效率。Ferrero等用相當(dāng)與Hp和Hf的尿素酶亞單位（UreA和Urab)編碼基因克隆到表達載體（pMAL)中去使大腸桿菌表達出轉(zhuǎn)譯的合成蛋白質(zhì)。重組的UreA和UreB蛋白質(zhì)與粘膜佐劑（霍亂毒素、CT)結(jié)合，經(jīng)口免疫小鼠。然后取胃粘膜活檢作尿素酶試驗和病理組織學(xué)檢查。結(jié)果證明不管是同源性還是異源性的UreA均能在小鼠中引起抗HF感染的保護性反應(yīng)。Ferrero認為通過本實驗?zāi)茏C明重組亞單位抗原能引起抗H屬細菌感染的免疫保護反應(yīng)。
Lee為了確定低劑量的CT或它的B亞單位（CTB)在H屬細菌口服疫苗中作為一個佐劑是否有效。他在下述三組免疫的APF級BLAB/c小鼠中完成對活的HF攻擊的明顯的保護作用。①HF抗原+0.5μgCT和10μgCTB(96%)；②HF抗原+0.5μgCT(45%)；③HF抗原+10μgCTB(85%)。單獨用HF抗原或單獨用佐劑免疫小鼠無任何保護作用。用HF抗原+10μgCT免疫小鼠對HF攻擊只有26%的保護作用。這預(yù)示無毒的CTB佐劑將可用于人類的免疫中。
張振華
上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室（200025)
