寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù):病原檢查及免疫論斷及新技術(shù)應(yīng)用

　　一、病原檢查

　�。ㄒ�)糞便檢查

　　糞便檢查是診斷寄生蟲病常用的方法。要取得準(zhǔn)確的結(jié)果，糞便必須新鮮，送檢時(shí)間一般不宜超過24小時(shí)。如檢查腸內(nèi)原蟲滋養(yǎng)體，最好立即檢查。盛糞便的容器要干凈，并防止污染與干燥；糞便不可混雜尿液等，以免影響檢查結(jié)果。

　　1．直接涂片法　用以檢查蠕蟲卵、原蟲的包囊和滋養(yǎng)體。方法簡便，連續(xù)作3次涂片，可提高檢出率。

　�、湃湎x卵檢查：滴一滴生理鹽水于潔凈的載玻片，用棉簽棍或牙簽挑取綠豆大小的糞便塊，在生理鹽水中涂抹均勻；涂片的厚度以透過涂片約可辨認(rèn)書上的字跡為宜。一般在低倍鏡下檢查，如用高倍鏡觀察，需加蓋片。應(yīng)注意蟲卵與糞便中異物的鑒別。蟲卵都具有一定形狀和大��；卵殼表面光滑整齊，具固有色澤；卵內(nèi)含卵細(xì)胞或幼蟲。

　�、圃�蟲檢查：

　　1)活滋養(yǎng)體檢查：涂片應(yīng)較薄，方法同查蠕蟲卵。氣溫愈接近體溫，滋養(yǎng)體的活動(dòng)愈明顯。必要時(shí)可用保溫臺(tái)保持溫度。

　　2)包囊的碘液染色檢查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理鹽水。如碘液過多，可用吸水紙從蓋片邊緣吸去過多的液體。若同時(shí)需檢查活滋養(yǎng)體，可在用生理鹽水涂勻的糞滴附近滴一滴碘液，取少許糞便在碘液中涂勻，再蓋上蓋片（圖21－1)。涂片染色的一半查包囊；末染色的一半查活滋養(yǎng)體。

圖21－1　原蟲包囊碘液染色操作方法

　　碘液配方：碘化鉀4g，碘2g，蒸餾水100ml。

　　3)隱孢子蟲卵囊染色檢查：目前較佳的方法為金胺酚改良抗酸染色法。對(duì)于新鮮糞便或經(jīng)10％福爾馬林固定保存（4℃1個(gè)月內(nèi))的含卵囊糞便都可用此法染色。染色過程是先用金胺－酚染色，再用改良抗酸染色法復(fù)染。方法步驟如下：

　　金胺－酚染色法：

　　①染液配制：1g／L金胺－酚染色液（第一液)：金胺0.1g，石碳酸5.0g，蒸餾水100ml；3％鹽酸酒精（第二液)：鹽酸3ml，95％酒精100ml；5g／L高錳酸鉀液（第三液)：高錳酸鉀0.5g，蒸餾水100ml。

　　②染色步驟：滴加第一液于晾干的糞膜上，10～15分鐘后水洗；滴加第二液，1分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置熒光顯微鏡檢查。

　　低倍熒光鏡下，可見卵囊為一圓形小亮點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)乳白色熒光。高倍鏡下卵囊呈乳白或略帶綠色，卵囊壁為一薄層，多數(shù)卵囊周圍深染，中央淡染，似環(huán)狀，或深染結(jié)構(gòu)偏位，有些卵囊全部為深染。但有些標(biāo)本可出現(xiàn)非特異的熒光顆粒，應(yīng)注意鑒別。

　　改良抗酸染色法：

　�、偃疽号渲疲菏�炭酸復(fù)紅染色液（第一液)：堿性復(fù)紅4g,　 95％酒精20ml，石炭酸8ml，蒸餾水100ml；10％硫酸溶液（第二液)：純硫酸10ml，蒸餾水90ml（邊攪拌邊將硫酸徐徐傾入水中；20g／L孔雀綠液（第三液)：20g／L孔雀綠原液1ml，蒸餾水10ml。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　�、谌旧�步驟：滴加第一液于糞膜上，1.5～10分鐘后水洗；滴加第二液，1～10分鐘后水洗；滴加第三液，1分鐘后水洗，待干；置顯微鏡下觀察。

　　經(jīng)染色后，卵囊為玫瑰紅色，子孢子呈月牙形，共4個(gè)。其他非特異顆粒則染成藍(lán)黑色，容易與卵囊區(qū)分。

　　不具備熒光鏡的實(shí)驗(yàn)室，亦可用上述方法先后染色，然后在光鏡低、高倍下過篩檢查，發(fā)現(xiàn)小紅點(diǎn)再用油鏡觀察。效果好，可提高檢出速度和準(zhǔn)確性。

　　2．厚涂片透明法（改良加藤法)取約5mg（已用100目不銹鋼篩除去糞渣)糞便，置于載玻片上，覆以浸透甘油－孔雀綠溶液的玻璃紙片，輕壓，使糞便鋪開（20×25mm)。置于30～36℃溫箱中約半小時(shí)或25℃約1小時(shí)。待糞膜稍干，即可鏡檢。

　　玻璃紙準(zhǔn)備：將玻璃紙剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油－孔雀綠溶液（含純甘油100ml、水100ml和3％孔雀綠1ml的水溶液)中，至少浸泡24小時(shí)，至玻璃紙呈現(xiàn)綠色。

　　使用此法需掌握糞膜的合適厚度和透明的時(shí)間。如糞膜厚，透明時(shí)間短，蟲卵難以發(fā)現(xiàn)；如透明時(shí)間過長，則蟲卵變形，也不易辨認(rèn)。

　　3．濃聚法

　�、懦恋矸ǎ涸�蟲包囊和蠕蟲卵的比重大可沉集于水底，有助于提高檢出率。但比重較小的鉤蟲卵和某些原蟲包囊則效果較差。

　　1)重力沉淀法：取糞便20～30g、加水成混懸液，經(jīng)金屬篩（40～60孔)或2、3層濕紗布過濾，再加清水沖洗殘?jiān)�；過濾糞液在容器中靜置25分鐘，倒去上液，重新加滿清水，以后每隔15～20分鐘換水一次（3～4次)，直至上液清晰為止。最后倒去上液，取沉渣作涂片鏡檢。如檢查包囊，換水間隔時(shí)間宜延長至約6小時(shí)換一次（圖21－2)。

圖21－2　糞便沉淀及毛蚴孵化法

　　2)離心沉淀法：將上述濾去粗渣的糞液離心（1500～2000rpm/min)1～2分鐘，倒去上液，注入清水，再離心沉淀，如此反復(fù)沉淀3～4次，直至上液澄清為止，最后倒去上液，取沉渣鏡檢。

　　3)汞碘醛離心（MIFC)沉淀法：糞便1g，加適量（約10ml)汞碘醛液，充分調(diào)勻，用2層脫脂紗布過濾，再加入乙醚4ml，搖2分鐘，離心（2000rpm/min)1～2分鐘，即分成乙醚、糞渣、汞碘醛及沉淀物4層。吸棄上面3層，取沉渣鏡檢。

　　汞碘醛配制：

　　①汞醛（MF)液：1／1000硫柳汞酊200ml，甲醛（40％)25ml，甘油50ml，蒸餾水200ml。
②盧戈氏液：碘5g，碘化鉀10g，蒸餾水100ml。

　　檢查時(shí)取汞醛液2.35ml及5％盧戈氏液0.15ml混合備用。但混合液在8小時(shí)后即變質(zhì)，不應(yīng)再用；碘液亦不這且于1周后再用。

　　4)醛醚沉淀法：置糞便1～2g于小容器內(nèi)，加水10～20ml調(diào)勻，將糞便混懸液經(jīng)2層紗布（或100目金屬篩網(wǎng))過濾，離心（2000rpm/min)2分鐘；倒去上層糞液，保留沉渣，加水10ml混勻，離心2分鐘；倒去上液，加10％甲醛7ml。5分鐘后加乙醚3ml，塞緊管口并充分搖勻，取下管口塞，離心2分鐘，即可見管內(nèi)自下而上分為4層。取管底沉渣涂片鏡檢。如檢查原蟲包囊，可加盧戈氏液染色，加蓋片鏡檢。

　�、聘【鄯ǎ豪�用比重較大的液體，使原蟲包囊或蠕蟲卵上浮，集中于液體表面。常用的方法有兩種：

　　1)飽和鹽水浮聚法：此法用以檢查鉤蟲卵效果最好。用竹簽取黃豆粒大小的糞便置于浮聚瓶（高3.5cm，直徑約2cm的圓形直筒瓶)中，加入少量飽和鹽水調(diào)勻，再慢慢加入飽和鹽水到液面略高于瓶口，但不溢出為止。此時(shí)在瓶口覆蓋一載玻片，靜置15分鐘后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，鏡檢（圖21－3)。

圖21－3　飽和鹽水浮聚法

　　飽和鹽水配制：將食鹽徐徐加入盛有沸水的容器內(nèi)，不斷攪動(dòng)，直至食鹽不再溶解為止。

　　2)硫酸鋅離心浮聚法：此法可用于檢查原蟲包囊，球蟲卵囊和蠕蟲卵。取糞便約1g，加10～15倍的水，充分?jǐn)囁�，按離心沉淀法過濾，反復(fù)離心3～4次，至水清為止，最后倒去上液，在沉渣中加入比重1.18的硫酸鋅液（33％的溶液)，調(diào)勻后再加硫酸鋅溶液至距管口約1cm處，離心1分鐘。用金屬環(huán)取表面的糞液置于載玻片上，加碘液一滴，鏡檢。

　　3)蔗糖離心浮聚法：此法適用于檢查糞便中隱孢子蟲的卵囊。取糞便約5g，加水15～20ml，以260目尼龍袋或4層紗布過濾。取濾液離心5～10分鐘，吸棄上清液，加蔗糖溶液（蔗糖500g，蒸餾水320ml，石炭酸6.5ml)再離心，然后如同飽和鹽水浮聚法，取其表液膜鏡檢（高倍或油鏡)。卵囊透明無色，囊壁光滑，內(nèi)有一小暗點(diǎn)和發(fā)出淡黃色的子孢子。隱孢子蟲的卵囊在漂浮液中浮力較大，常緊貼于蓋片之下，但1小時(shí)后卵囊脫水變形不易辨認(rèn)，故應(yīng)立即鏡檢。也可用飽和硫酸鋅溶液或飽和鹽水替代蔗糖溶液。

　　常見蠕蟲卵、包囊的比重如表21－1。

表21－1　蠕蟲卵及包囊的比重

　　4．毛蚴孵化法　依據(jù)血吸蟲卵內(nèi)的毛蚴在適宜溫度的清水中，短時(shí)間內(nèi)可孵出的特性而設(shè)計(jì)的方法，適用于星期血吸蟲病患者的糞便檢查。取糞便約30g，先經(jīng)重力沉淀法濃集處理，將糞便沉渣倒入三角燒瓶內(nèi)，加清水（城市中需用去氯水)至瓶口，在20～30℃的條件下經(jīng)4～6小時(shí)后肉眼或放大鏡觀察結(jié)果。如見水面下有白色點(diǎn)狀物作直線來往游動(dòng)，即是毛蚴。必要時(shí)也可用吸管將毛蚴吸出鏡檢。如無毛蚴，每隔4～6小時(shí)（24小時(shí)內(nèi))觀察一次。氣溫高時(shí)，毛蚴可在短時(shí)間內(nèi)孵出，因此在夏季要用1.2％食鹽水或冰水沖洗糞便，最后一次才改用室溫清水（圖21－2)。醫(yī).學(xué).全.在線.網(wǎng).站.提供

　　毛蚴促孵法：將沉淀法處理后的糞便沉渣置于三角瓶內(nèi)，不加水，或?qū)⒓S渣置于吸水紙上，再放在20～30℃溫箱中過液。檢查時(shí)，加清水，2小時(shí)后就可見到孵出的毛蚴。此法毛蚴孵出時(shí)間較一致，數(shù)量也較多。

　　5．肛門拭子檢查法　適用于在肛周產(chǎn)卵（蟯蟲)，或常在肛門附近發(fā)現(xiàn)蟲卵（帶絳蟲)的蟲卵檢查法。

　�、琶藓炇米臃ǎ合葘⒚藓灲�泡在生理鹽水中，取出時(shí)擠去過多的鹽水，在肛門周圍擦拭，隨后將棉簽放入盛有飽和鹽水的試管中，用力攪動(dòng)，迅速提起棉簽，在試管內(nèi)壁擠干鹽水后充去，再加飽和鹽水至管口處，覆蓋一載玻片，務(wù)使其接觸液面，5分鐘后取載玻片鏡檢。也可將擦拭肛周的棉簽放在盛清水的試管中，經(jīng)充分浸泡，取出，在試管內(nèi)壁擠去水分后棄去。試管靜置10分鐘，或經(jīng)離心后，倒去上液，取沉渣鏡檢。

　�、仆该髂z紙法：用長約6cm，寬約2cm的透明膠紙粘擦肛門周圍的皮膚，取下膠紙，將有膠面平貼玻片上，鏡檢。

　　6．試管濾紙培養(yǎng)法　也稱鉤蚴培養(yǎng)法。根據(jù)鉤蟲卵在適宜條件下可在短時(shí)間內(nèi)孵出幼蟲的原理設(shè)計(jì)的方法。如冷開水約1ml于潔凈試管內(nèi)（1×10cm)，將濾紙剪成與試管等寬但較試管稍長的T字型紙條，用鉛筆書寫受檢者姓名或編號(hào)于橫條部分。取糞便約0.2～0.4g，均勻地涂抹在緊豎條紙條的上部2／3處，再將紙條插入試管，下端浸泡在水中，以糞便不接觸水面為度。在20～30℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天沿管壁補(bǔ)充冷開水，以保持水面位置。3天后肉眼或放大鏡檢查試管底部。鉤蚴在水中常作蛇形游動(dòng)，蟲體透明。如未發(fā)現(xiàn)鉤蚴，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5天。氣溫太低時(shí)可將培養(yǎng)管放入溫水（30℃左右)中數(shù)分鐘后，再行檢查（圖21－4)。

圖21－4　鉤蚴培養(yǎng)法

　　此法亦可用于分離人體腸道內(nèi)各種阿米巴滋養(yǎng)體及人毛滴蟲滋養(yǎng)體，且能提高檢出率。但是，每管糞便量應(yīng)為1.0g；適宜溫度為25～30℃；培養(yǎng)時(shí)間為2～4天。臨床上為了及時(shí)報(bào)告致病原蟲，可于培養(yǎng)48小時(shí)后鏡檢。檢查腸道各種原蟲，仍應(yīng)結(jié)合碘液涂片法以檢出原蟲包囊。

　　7．蟲卵計(jì)數(shù)法　蟲卵計(jì)數(shù)用于估計(jì)人體內(nèi)寄生蟲的感染度，常用司徒爾（Stoll)氏法，即司氏稀釋蟲卵計(jì)數(shù)法（圖21－5)。

圖21－5　　司氏蟲卵計(jì)數(shù)法

圖21－6　 定量板

　　用特制的三角燒瓶（或普通三角燒瓶)，容量為65ml左右，在燒瓶的頸部相當(dāng)于56和60ml處有兩個(gè)刻度。先把0.1mol/l NaOH溶液倒入瓶內(nèi)至56ml處，再慢慢地加入糞便，到液面上升到60ml處，然后放進(jìn)玻璃珠10余顆，用橡膠塞塞緊瓶口，充分搖動(dòng)，使其成為十分均勻的混懸液。醫(yī)學(xué).全在線www.med126.com

　　計(jì)數(shù)時(shí)充分搖勻，用有刻度的小吸管取0.075或0.15ml糞液置于載玻片上，加蓋片，在低倍鏡下計(jì)算全片的蟲卵數(shù)。乘以200（吸0.075ml)或100（吸0.15ml)即得每克為糞便蟲卵數(shù)。由于糞便的性狀明顯地影響估算結(jié)果，因此不成形的糞便的蟲卵數(shù)應(yīng)再乘糞便性狀系數(shù)，即半成形糞便×1.5，軟濕形糞便×2，粥狀糞便×3，水瀉形糞便×4。

每克糞便含卵數(shù)×24小時(shí)糞便克數(shù)　
雌蟲數(shù)＝　已知雌蟲每天排卵總數(shù)

成蟲總數(shù)＝雌蟲總數(shù)×2

　　8．定量透明法　適用于各種糞便內(nèi)蠕蟲卵的檢查及計(jì)數(shù)。此法系應(yīng)用改良聚苯乙烯作定量板（圖21－6)，大小為40×30×1.37mm，模孔為一長圓孔，大小為8×4mm，兩端呈半圓形，所取的糞樣平均為41.7mg。操作時(shí)將大小約4×4cm的100目尼龍網(wǎng)或金屬篩網(wǎng)覆蓋在糞便標(biāo)本上，自篩網(wǎng)上用刮片刮取糞便，置定量板于載玻片上，用一手的兩指壓住定量板的兩端，將刮片上的糞便填滿模孔，刮去多余糞便。掀起定量板，載玻片上留下一個(gè)長形糞樣，然后在糞條上覆蓋含甘油－孔雀綠溶液的大小約為5.0～2.6cm的玻璃紙條，展平后加壓，使玻璃紙下的糞便鋪成長橢圓形。經(jīng)1～2小時(shí)糞便透明后置鏡下計(jì)數(shù)。將所得蟲卵數(shù)×24，再乘上述糞便性狀系數(shù)，即為每克糞便蟲卵數(shù)（eggs 　per　gram，EPG)。常見蠕蟲的每條雌蟲每天排卵數(shù)如表21－2。

表21－2　各種蠕蟲每條雌蟲每日排卵數(shù)

　　9．淘蟲檢查法　為考核驅(qū)蟲療效，常需從糞便中淘取蠕蟲進(jìn)行鑒定與計(jì)數(shù)。取患者服藥后24～72小時(shí)的全部糞便，加水?dāng)嚢瑁�用篩（40目)或紗布濾出糞渣，經(jīng)水反復(fù)沖洗后，倒在盛有清水的大型玻皿內(nèi)。檢查混雜在糞渣中的蟲體時(shí)，應(yīng)在玻皿下襯以黑紙。

　　10．帶絳蟲孕節(jié)檢查法　絳蟲節(jié)片用清水洗凈，置于兩載玻片之間，輕輕壓平，對(duì)光觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并根據(jù)子宮分支情況鑒定蟲種。也可用注射器從孕節(jié)后端正中部插入子宮內(nèi)徐徐注射炭素墨汁或卡紅，待子宮分支顯現(xiàn)后計(jì)數(shù)。

　　卡紅染液配制：鉀明礬飽和液100ml，卡紅3g，冰醛酸10ml。混合液置于37℃溫箱內(nèi)過夜，過濾后即可應(yīng)用。

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