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您現在的位置: 醫(yī)學全在線 > 理論教學 > 基礎學科 > 生物化學與分子生物學 > 正文:基因序列導入細胞
    

基因序列導入細胞

  目的基因序列與載體連接后,要導入細胞中才能繁殖擴增,再經過篩選,才能獲得重組DNA分子克隆,不同的載體在不同的宿主細胞中繁殖,導入細胞的方法也不相同。

  一、轉化

  由于外源DNA的進入而使細胞遺傳性改變稱為轉化,早在1943年,Avery等就發(fā)現有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉化現象。但DNA進入細胞的效率很低,在分子生物學和基因工程工作中可采取一些方法處理細胞,經處理后的細胞就容易接受外界DNA,稱為感受態(tài)細胞,再與外源DNA接觸,就能提高轉化效率。例如大腸桿菌經冰冷CaCl2的處理,就成為感受態(tài)細菌,當加入重組質粒并突然由4℃轉入42℃作短時間處理,質粒DNA就能進入細菌;用高電壓脈沖短暫作用于細菌也能顯著提高轉化效率,這稱為電穿孔(electroporation)轉化法。

  二、感染

  噬菌體進入宿主細菌,病毒進入宿主細胞中繁殖就是感染(infection)。用經人工改造的噬菌體活病毒作載體,以其DNA與目的序列重組后,在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒,就能以感染的方式進入宿主細菌或細胞,使目的序列得以復制繁殖。感染的效率很高,但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。醫(yī)學全在.線提供

  三、轉染

  重組的噬菌體DNA也可象質粒DNA的方式進入宿主菌,即宿主菌先經過CaCl2,電穿孔等處理成感受態(tài)細菌再接受DNA,進入感受態(tài)細菌的噬菌體DNA可以同樣復制和繁殖,這種方式稱為轉染(transfection)。M13噬菌體DNA導入大腸桿菌就常用轉染的方法。重組DNA進入宿主細胞也常用轉染方式。最經典的是1973年建立的磷酸鈣法,其利用的基本現象是:DNA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現時,培養(yǎng)細胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細胞也能提高細胞攝取DNA能力,但所用外加電場的強度、電脈沖的長度等條件與處理細菌者都很不相同。近年來用人工脂質膜包裹DNA,形成的脂質體(Liposome)可以通過與細胞膜融合而將DNA導入細胞,方法簡單而有效,現有商售的脂質體試劑,使用日益廣泛。

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