附：核酸探針?biāo)夥ǎㄒ苑派湫詷?biāo)記探針為例)
�。�1)按下列比例混合
探針溶解于水 160μl無菌蒸餾水加入含標(biāo)記探針沉淀物的Eppendrof管中
0.4mol/L NaHCO3 20μl
0.6mol/L Na2CO3 20μl
混合后孵育于60℃水浴，其孵育時間由下式推算：
孵育時間= LO –Lf/K×LO–Lf
LO：核酸探針原長度（Kb)
Lf ：核酸探水解后所需長度（Kb)
K：是一常數(shù)0.11Kb/min
�。�2)在室溫中加入下列配方以終止水解
3mol/L 醋酸鈉 6.6μl(最終濃度0.1mol/L)
醋酸1.3μl(最終濃度0.5%)
�。�3)加下列配方沉淀探針
7mol/L 醋酸銨100μl
100%乙醇750μl
tRNA(10mg/ml) 2μl
置于—20℃2h后回暖至室溫，在14000rpm離心30min。
�。�4)小心將乙醇輕輕傾出，待試管內(nèi)干燥后再用無菌蒸餾水稀釋到10ng/μl濃度。
�。�5)應(yīng)用放射性標(biāo)記測定法測定其放射比活性（詳見第十九章 )，然后調(diào)到5ng/μl濃度。
3．雜交的溫度和時間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環(huán)節(jié) 。在第十八章 概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（melting temperature, 簡稱Tm)。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide)于雜交液中。McConaughy報告，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調(diào)節(jié) 鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié) Tm。Tm的計算公式在第十九章 有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié) 等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時間5～15min，（有作用報告在105℃微波爐加熱使之變性)，然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2×SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過夜。
雜交的時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時間在3h左右。Barns等（1987)報告用DNA探針雜交，其反應(yīng)完成時間為2～4h。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應(yīng)時間定為16～20h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報告看無不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應(yīng)時間應(yīng)予考慮，并經(jīng)反復(fù)實驗確定。
有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因為光線會促進(jìn)甲酰胺的電離作用。
4．雜交嚴(yán)格度（Hybridization stringency)雜交條件的嚴(yán)格度（stringency)表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對(mismatch)雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。一般來說，低嚴(yán)格度（low stringency)雜交及沖洗條件在Tm -35℃至Tm –40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴(yán)格度（high stringency)為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。麥躍行裝用地高辛標(biāo)記原位雜交技術(shù)檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格條件下（Tm-12℃)各型病毒DNA的檢出率和陽性率明顯低于非嚴(yán)格條件下（Tm-35℃)，其相差非常明顯（P<0.001)。因為，在嚴(yán)格條件下只有同源性很強(qiáng)的DNA才被檢出，而在非嚴(yán)格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行，而低嚴(yán)格條件則可用于對病毒感染進(jìn)行篩選。
由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25℃進(jìn)行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無疑會產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強(qiáng)雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用cRNA探針進(jìn)行細(xì)胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實驗證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈cDNA要強(qiáng)。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。
5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)和甲酰胺（formamide)硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合（hydrate)作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應(yīng)用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。
甲酰胺的主要作用在上節(jié) 已提及，在調(diào)節(jié) 雜交反應(yīng)溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。
�。ㄋ�)雜交后處理（post hybridisation treatment)
雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。在原位雜交組織化學(xué)的實驗程序中，這也是一個重要的環(huán)節(jié) 。特別因為大多數(shù)的原位雜交實驗是在低嚴(yán)格度條件下進(jìn)行的，非特異性的探針片段粘附在組織切片上，從而增強(qiáng)了背景染色。RNA探針雜交時產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法檢測背景染色（非特異性標(biāo)記的多少)作為改善漂洗程序的指針。在35S標(biāo)記的核酸探針在漂洗液中須加入14mmol/L的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol)或硫代硫酸鹽（thiosulphate)，以防止35S標(biāo)記的核酸探針被氧化�？傊�，如何控制漂洗的嚴(yán)格度從而達(dá)到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復(fù)的實踐中取得經(jīng)驗。
