五、沒有圖像分析儀可否進行圖像分析？
當沒有圖像分析儀時，研究者早已想到用網(wǎng)格來進行圖像分析，也獲得了客觀的評定結(jié)果。網(wǎng)格可分為兩大類：一類是置于目鏡內(nèi)的網(wǎng)格，可測量切片標本上的各種數(shù)據(jù)；另一類是大的網(wǎng)格，可放在照片上，光鏡電鏡照片均可用，對照片上的各種結(jié)構(gòu)可進行測量。以上二者至今仍被采用。英國標線片公司提供許多型號的市售標線片（即網(wǎng)格)。有的國家制造的顯微鏡，將目鏡與帶有六種不同型號標線片的旋轉(zhuǎn)盤裝在一起，以便于觀察者作各種測量。國內(nèi)某些單位有自制標線片，并有少量出售。
Aalto等1982年曾在“免疫組織化學(xué)的形態(tài)測量法一卵巢腫瘤內(nèi)的胚性癌抗原”一文中推薦用視野評分法，他用三種方法對PAP法免疫組化標本進行分析：①對全切片的染色進行分級。②在10×10放大倍數(shù)下，每一切片用目鏡網(wǎng)格任選25個方形視場進行觀察，并對每一視場進行分級。③在25個視場內(nèi)取25個點的著色強度進行分級。染色強度分為0級、1級（輕度)2級、（中度)、3級（重度)。方法①的結(jié)果不同于②③，而方法②和③差別不大，說明主觀估算的鑒別能力低，一般鏡下觀察不能確切反映染色強度。
用網(wǎng)格進行圖像分析的方法很多，如用免疫熒光等方法顯示神經(jīng)纖維，要表示各處的纖維密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用網(wǎng)格法就要客觀一些，在目鏡或照片上放上網(wǎng)格，觀察陽性神經(jīng)纖維與網(wǎng)格上的線條的交叉次數(shù)，排列密集的區(qū)域交叉次數(shù)必然多些，這就比較客觀，重復(fù)性也較好。
用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標本，Ploem曾在1977年指出熒光強度之差至少要二倍才能在直觀估計時顯示出差別，說明人視覺對熒光強度變化不夠敏感。作者在工作中體會到，可利用照相的自動曝光系統(tǒng)來作相對定量，因為熒光愈強則自動曝光時間愈短，熒光弱則自動曝光時間長，相當敏感，用眼睛觀察二個熒光強度幾乎無差別的細胞，也能在自動曝光時間上顯示出差別來。作者曾經(jīng)將許多熒光標本用相同的曝光時間拍在同一個膠卷中，沖洗后，熒光強的區(qū)域膠卷上顯色深，熒光弱的區(qū)域膠卷上顯色淺，因為熒光容易淬滅，用此法可將膠卷較長期保存，而且膠卷上的信息還可通過圖像分析儀測灰度等數(shù)據(jù)。這些都是在實踐中的一點經(jīng)驗，供讀者參考。
用網(wǎng)格測量的具體操作舉例：圖9-4為一關(guān)聯(lián)方測格，由于測點、測線、測面之間有互相關(guān)聯(lián)的關(guān)系，故稱為關(guān)聯(lián)方測格。方格直線交叉稱為測點，總數(shù)為100個，方格中所有直線稱為測線，小方格邊長為d如圖中所示，測線總長度為200d,整個大方格為測面，測面總面積為100d2，測格周圍的虛線不是測線。關(guān)聯(lián)測格的優(yōu)點是：只在計數(shù)位于欲測圖像中的測點數(shù)P，就可計算位于該圖像中的測線長度L及測面的面積A。計算方法為：L=2d·P，A=d2·P。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
可將圖9-4攝制于小的透明膠片上，剪成你所用的目鏡筒的內(nèi)徑大小，將其置于目鏡內(nèi)，使測格清晰地疊映組織標本的圖像上，則可進行測量。d的長度可用臺微尺來確定。也可將9-4復(fù)印在較大的透明膠片上，可用來測量電鏡照片或光鏡照片，將透明膠片疊加在照片上即可進行測量。圖9-5為一測量的例子：
圖9－4 關(guān)聯(lián)方測格
圖9-5 示測點計數(shù)
此關(guān)聯(lián)方測格共有測點100個（如果只計數(shù)粗測點則有25個)，圖像為一個腎小體的輪廓，包括血管球和腎小囊腔，測點計數(shù)的結(jié)果，在腎小囊腔內(nèi)的測點數(shù)為12，在血管球內(nèi)的測點為49個，整個腎小體內(nèi)的測點為12+49=61個，用臺微尺測出d的長度，則可得到此圖像中腎小囊腔的面積，血管球的面積，腎小體的面積。明小囊腔與腎小體的面積比12：61=19.7%等多個參數(shù)。
值得提出的是，在顯微鏡下網(wǎng)格的線條有一定寬度，如圖9-6所示。計數(shù)測點時如①箭頭所示，即橫線上緣與豎線右緣交點處為真正的測點，若此點落在圖像外面則不能計數(shù)。如②箭頭所示，此測線的上緣才能作為真正的測線。
圖9-6 示真正的測點與測線
表面積密度的測定：免疫細胞化學(xué)電鏡照片中的膜性結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細胞膜等都可測定表面積密度，光鏡標本中的各種結(jié)構(gòu)也可同樣測定。表面積密度是指單位體積參照空間內(nèi)特征物的表面積，通過數(shù)學(xué)運算可簡便地用以下方法測定：測量單位面積參照面內(nèi)特征物斷面周界線的長度。如果某一個細胞的電鏡照片作為參照面，線粒體作為特征物，欲測單位面積電鏡照片內(nèi)線粒體斷面周界線的長度，可用以下公式：
SV=2IL
SV表面積密度2IL交點密度
IL=測線與特征物斷面周界線之間的交叉點數(shù)除以參照面內(nèi)測線總長度。
圖9-7為一咱擺線測格，可用來方便地測表面積密度。圖中的平行直線不是測線，僅是為了便于計數(shù)交叉點和測點而畫上的。圖中的曲線即擺線，也就是測線，共45條，每條擺線長度d=1/10測格寬度(1cycloid arc =1/10×frame width) ，測格的寬度容易測量，如用目鏡測格，可用臺微尺測量，如用大的透明膠片，可實際用尺測量，因此每條擺線長度很易算出。測格中共有45條擺線，其總長為45d。圖中直角短線（L)示測點，共90個，測線長度L與測點數(shù)P的關(guān)聯(lián)關(guān)系為L=d/2·P。具體來說，用圖9-7擺線測格，置于一個細胞的超微結(jié)構(gòu)照片上，如果整個測格均位于照片內(nèi)，則參照面內(nèi)測線總長度為45d,如果90個測點只有60個落至細胞內(nèi)（即測格中有30個測點落在此照片外)則參照面內(nèi)的測線總長度為d/2·P=d/2×60=30d。擺線與特征物（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體的膜等)的交叉點容易數(shù)，用上述IL和SV公式即可得出所需參數(shù)。此公式為經(jīng)過數(shù)學(xué)上的研究而得出，我們可應(yīng)用公式來作表面積密度的研究。
