膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理，一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)，如果＝低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，二者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb S—400 （丙烯葡聚糖S—400)層析分離純化膠體金蛋白標(biāo)記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。
一、待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備
�。�1)透析除鹽：蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì)，不然過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質(zhì)的吸附，因此，標(biāo)記之前必須徹底除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的鹽水（0.005mol/l NaCl , pH7.0)透析。
�。�2)去除蛋白質(zhì)中的沉淀：長(zhǎng)期低溫保存的蛋白質(zhì)或4℃較長(zhǎng)時(shí)間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響，因此，標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg./ml即可用于標(biāo)記。
二、膠體金pH值的調(diào)整
膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1n HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可。
幾種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值見表5-4。
表5-4 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值如下
| 蛋白質(zhì) | pH |
| 抗體（γ球蛋白) | 9.0 |
| 親合層析的IgG | 7.6 |
| 單克隆抗體 | 8.2 |
| F（ab＇)2 | 7.2 |
| SPA(葡萄球菌蛋白) | 6.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅰ | 8.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅱ | 8.0 |
| 花生凝集素 | 6.3 |
| Helix pomatia lectin | 7.4 |
| 大豆凝集素 | 6.1 |
| Lens Culinaris lectin | 6.9 |
| Lotus Tetragonolobus lectin | 6.3 |
| 荊豆凝集素 | 6.3 |
| Bandeirae simplicifolia lectin | 6.2 |
| 過(guò)氧化物酶 | 8.0 |
| 類卵粘蛋白 | 4.8 |
| 血漿銅蘭蛋白 | 7.0 |
| α-胎球蛋白 | 6.5 |
| 小牛血清白蛋白 | 6.5 |
| 牛血清白蛋白 | 5.5 |
| 牛血球白蛋白結(jié)合肽 | 4.5 |
| 牛血清白蛋白結(jié)合胰島素 | 5.3 |
| 霍亂毒素 | 6.9 |
| 破傷風(fēng)毒素 | 6.9 |
| DNAase | 6.0 |
| RNAase | 9.0 |
| 低密度脂蛋白 | 5.5 |
| α2-巨球蛋白 | 6.0 |
| 抗生物素蛋白（親合素) | 10.0 |
| 鏈霉抗生物素蛋白 | 6.6 |
| 麥胚凝集素 | 9.9 |
三、待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定量的測(cè)定
�。�1)光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml)，分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測(cè)定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45μg/ml。
圖5-2 蛋白最適穩(wěn)定量示意圖
�。�2)目測(cè)法：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進(jìn)行。醫(yī).學(xué).全.在.線bhskgw.cn
表5-5 具體的做法是按表內(nèi)進(jìn)行
| 管數(shù) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 膠體金（ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 蛋白質(zhì)（μg) | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 0 |
| 10%NaCl(ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
�、佼�(dāng)分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。
�、跊]有加入蛋白質(zhì)的管為對(duì)照管。
�、坌∮�5nm顆粒的膠體金溶液，每個(gè)管內(nèi)應(yīng)加入5μl33%的雙氧水，否則有不變藍(lán)色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實(shí)際用量。
