5)脫鹽：蛋白質(zhì)、酶用鹽析法沉淀分離后，常需脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析法，如圖2-1所示：把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，袋的二端用線扎緊，然后用蒸餾水或緩沖液進(jìn)行透析，這時(shí)鹽離子通過(guò)透析袋擴(kuò)散到水或緩沖液中，蛋白質(zhì)分子量大不能穿透析袋而保留在袋內(nèi)，通過(guò)不斷更換蒸餾水或緩沖液，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。透析需要較長(zhǎng)時(shí)間，常在低溫下進(jìn)行，并加入防腐劑避免蛋白質(zhì)和酶的變性或微生物的污染。
此外用葡聚糖凝膠脫鹽的效果也很好，其原理和應(yīng)用方法在這里不贅述。
圖2-1 透析裝置圖
�。�2)有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外，有機(jī)溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱“有機(jī)溶劑分段沉淀法”，它常用于蛋白質(zhì)或酶的提純。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機(jī)溶劑易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作必須在低溫下進(jìn)行，并在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以避免局部濃度過(guò)大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過(guò)濾或離心沉降，分離后的蛋白質(zhì)沉淀，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度。操作時(shí)的pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度，減少變性，提高分離的效果，在有機(jī)溶劑中添加中性鹽的濃度為0.05mol/L左右，中性鹽過(guò)多不僅耗費(fèi)有機(jī)溶劑，可能導(dǎo)致沉淀不好。沉淀的條件一經(jīng)確定，就必須嚴(yán)格控制，才能得到可重復(fù)的結(jié)果。有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度表示。有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)分辨力比鹽析法好，溶劑易除去；缺點(diǎn)是易使酶和具有活性的蛋白質(zhì)變性。故操作時(shí)要求條件比鹽析嚴(yán)格。對(duì)于某些敏感的酶和蛋白質(zhì)，使用有機(jī)溶劑沉淀尤其要小心。
�。�3)等電點(diǎn)沉淀法：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低而各種蛋白質(zhì)又具有不同等電點(diǎn)的特別進(jìn)行分離的方法，稱為等電點(diǎn)沉淀法。但在等電點(diǎn)時(shí)，各種蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而使沉淀不完全，同時(shí)許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，故單獨(dú)使用此法效果不理想，分辨力也差。大多用于提取后去除雜蛋白，即利用變動(dòng)提取液的pH值使某些與待提純的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白從溶液中沉淀出。實(shí)際工作中常把等電點(diǎn)沉淀和鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。
（4)吸附法：在蛋白質(zhì)的提純方法中，選擇性吸附也是應(yīng)用歷史較久迄今仍在廣泛采用的方法之一。早期工作常用高嶺土 （我國(guó)的一種土質(zhì)，其分子式大致是AL2O3·2SiO2·2H2O)、氧化鋁（AL2O3)及活性炭等吸附劑，由于這些吸附劑吸附力較弱，或者易引起蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用不廣，現(xiàn)已為凝膠性吸附劑所代替，如氫氧化鋁凝膠和磷酸鈣凝膠，尤其后者使用最廣。吸附劑的應(yīng)用有兩種不同方式。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)較易吸附時(shí)，可以選擇適當(dāng)條件主要吸附蛋白質(zhì)而分離去雜質(zhì)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)較難吸附時(shí)，則選擇利于吸附雜質(zhì)條件將雜質(zhì)與蛋白質(zhì)分開(kāi)。有時(shí)兩種方法可先后使用，以達(dá)到較高的提純目的。吸附條件通常在微酸性條件（pH5～6)及稀鹽溶液中進(jìn)行，鹽濃度過(guò)高會(huì)干擾對(duì)蛋白質(zhì)及酶的吸附，亦即是說(shuō)需要用更多量的吸附劑才能達(dá)到一定結(jié)果。洗脫時(shí)一般在弱堿條件下或適當(dāng)提高洗脫液離子強(qiáng)度，可將吸附的蛋白質(zhì)或酶完全洗脫下來(lái)。
吸附操作可以用靜態(tài)吸附，也可以用柱層析吸附，即將凝膠裝成柱進(jìn)行吸附操作。凝膠裝柱后如溶液的通過(guò)能力很差，可用助濾劑（如硅藻土)和凝膠混合，當(dāng)調(diào)整二者的比例時(shí)得到一系列通過(guò)能力和吸附能力不同的層析柱。最近還使羥基磷灰石[Ca10(PO4)6．（OH)2]分離蛋白質(zhì)和酶，它可以在高鹽濃度下吸附中性及酸性蛋白質(zhì)而排除堿性蛋白質(zhì)。吸附常在pH6.8的磷酸緩沖液中進(jìn)行。洗脫完全時(shí)凝膠可反復(fù)使用3～4次，吸附雜質(zhì)較多的凝膠以0.1mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸洗凈后再用。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com
�。�5)離子交換法：蛋白質(zhì)和酶都具有電解質(zhì)性質(zhì)，故可用離子交換劑進(jìn)行分離提純，特別是經(jīng)過(guò)了初步純化后的蛋白質(zhì)和酶采用此法效果尤為顯著。有關(guān)離子交換劑及其使用技術(shù)，參閱有關(guān)專著，這里介紹近年來(lái)以纖維素衍生物作為離子交換劑純化蛋白質(zhì)及酶的方法。在這類衍生物中以二乙氨基乙基纖維素（簡(jiǎn)稱DEAE-纖維素，為陰離子交換劑)及甲基纖維素（簡(jiǎn)稱CM-纖維素，為陽(yáng)離子交換劑)應(yīng)用最廣泛。
DEAE-纖維素是纖維素結(jié)構(gòu)中的氫原子被一定量的二乙氨基-乙基取代而成弱堿性化合物，它作為陰離子交換劑的原理是：
在實(shí)際工作中常用磷酸緩沖液平衡DEAE-纖維素后，才對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行交換吸附的，故上式B-可視為PO3-。用DEAE-纖維素吸附酶和蛋白質(zhì)時(shí)常用pH為7～9，然后提高鹽濃度（使蛋白質(zhì)與交換劑的結(jié)合鍵減弱)或降低pH使之洗脫，洗脫后的蛋白質(zhì)溶液有時(shí)可進(jìn)一步上CM-纖維素柱純化。作為陽(yáng)離子交換劑，CM-纖維素吸附蛋白質(zhì)的原理如下：
式中A+可為H+或Na+，視平衡CM－纖維素時(shí)所用溶劑而定。CM－纖維素常選在pH4.5～6.0左右吸附蛋白質(zhì)，然后提高pH或鹽濃度進(jìn)行洗脫。離子交換纖維素對(duì)大分子物質(zhì)有較大交換量，例如CM-纖維素對(duì)血紅蛋白的交換量為93～98mg/100mgCM-纖維素。此外，纖維素離子交換劑還具有層析條件溫和、物質(zhì)易于洗脫、分辨力強(qiáng)、被分離的蛋白質(zhì)不易變性等優(yōu)點(diǎn)。
除了纖維素離子交換劑外，離子交換凝膠也是目前應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)和酶的一種很好的離子交換劑。常用的有DEAE-葡聚糖凝膠和CM-葡聚糖凝膠。離子交換凝膠不僅具有交換當(dāng)量高、層析條件溫和、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，而且兼具分子篩的性能，在梯度洗脫時(shí)，對(duì)不同分子量的蛋白質(zhì)具有很高的分辨能力。
2．核酸的分離純化 從細(xì)胞中提取核酸后，仍混雜著蛋白質(zhì)、多糖和各種大小分子核酸同類物。除去這些“雜質(zhì)”的過(guò)程，也就是核酸提純過(guò)程。在核酸的分離純化時(shí)，為防止核酸大分子的變性降解，必須在0～4℃的低溫條件下操作。核酸酶的水解作用，是過(guò)去制備具有活性核酸大分子的嚴(yán)重障礙，現(xiàn)普遍采用加入去污劑或加入EDTA、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉以除去核酸酶的激活劑Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保證在提純過(guò)程中核酸大分子的完整。關(guān)于核酸分離純化階段中除去多糖、蛋白質(zhì)及不同類型核酸之間分離的一些方法，分別介紹如下：
�。�1)肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化學(xué)性質(zhì)與核酸有許多相似之處，常在提取液中殘存下來(lái)。除去的方法常有：①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動(dòng)物饑餓數(shù)天然后殺死，可使細(xì)胞內(nèi)肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機(jī)層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。
�。�2)蛋白質(zhì)的除去：由于核酸在細(xì)胞內(nèi)以核蛋白體形式存在，不論采用哪種方法提取核酸，蛋白質(zhì)都不同程度地存在于體系中。因此，除去蛋白質(zhì)是核酸分離純化不可避免的步驟。常用方法有下列幾種：①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復(fù)使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結(jié)合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對(duì)提取液搖蕩抽提，蛋白質(zhì)在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復(fù)使用。③苯酚水溶液抽提，在對(duì)氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進(jìn)入水相，蛋白質(zhì)則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。
