�。�3)不同類型核酸的分離：兩種類型核酸的制備過程中，DNA制品中混雜著少量RNA或RNA制品中混雜著少量DNA是經(jīng)常發(fā)生的。由于DNA和RNA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都很相似，而且分子量都十分大，所以兩類核酸的分離是核酸純化工作中比較復(fù)雜和繁瑣的一步。從DNA中除去RNA的方法常有：①核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，這是比較有效的方法，但使用的核糖核酸酶中常含有極微量的脫氧核糖核酸酶，必須事先加熱處理除去，然后將純凈的核糖核酸酶與樣品溶液一起在37℃孵育數(shù)分鐘，就可達(dá)到破壞RNA的目的。②鈣鹽分步沉淀：在核酸溶液中加入1/10體積10%的氯化鈣溶液，使DNA與RNA均成為鈣鹽后，再利用DNA鈣鹽在2/10體積乙醇中能形成沉淀析出，RNA鈣鹽不形成沉淀而彼此分離。③活性炭吸附：將處理好的活性炭按1/15～1/20體積加入每毫升含有0.5～1mgDNA溶液中，0～4。C下攪拌1h ，以31000×g離心1h，除去RNA后的DNA回收率可達(dá)94%。
在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在沒有陰離子化合物存在下，以等體積90%苯酚水溶液反復(fù)抽提RNA，可以除去絕大部分DNA。此外，也可采用加入脫氧核糖核酸酶處理，破壞DNA，或參考上述DNA與RNA分離方法將DNA除去。
�。�4)同類核酸的分離
�、賀NA混合物的分離：經(jīng)過提取的初步純化的RNA制品中含有各類RNA和某些已降解的RNA混雜物。進(jìn)一步純化時(shí)，多應(yīng)用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。例如tRNA與rRNA的分離用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后，以不同梯度氯化鈉溶液洗脫，或用蔗糖梯度（頂部5%濃度，底部20%濃度)離心法分開。mRNA的代謝速度較快，在細(xì)菌中平均壽命為90min，在哺乳動(dòng)物中約為幾小時(shí)至十幾小時(shí)，常用密度梯度離心法和DNA-瓊脂柱進(jìn)行分離。制備rRNA時(shí)，由于共沉作用，�；煊衜RNA，一般可用萘-1，5-二磺酸處理，使二者分開。各種tRNA的提純，通常采用逆流分溶法在磷酸緩沖液-甲酰胺-異丙醇系統(tǒng)下進(jìn)行，分離效果較好。
�、贒NA混合物的分離：主要是變性或降解的DNA和天然的分離，常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。一個(gè)具有生物活性高度提純的DNA制品應(yīng)具有如下標(biāo)準(zhǔn)：不含有蛋白質(zhì)及多糖；不含有可透析的小分子雜物；在pH7時(shí)紫外吸收最大值在257～261μm之間，E（P)在6600左右；不含有RNA；固體為纖維狀，水溶液具有高的粘度并有流動(dòng)雙折射作用；具有電泳均一性及超離心中單分散性；具有生物活性。
�。ㄎ�)抗原的濃縮
濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑（包括水)變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程，在制備生物大分子及各種生化產(chǎn)品時(shí)，常在提取后和結(jié)晶前進(jìn)行濃縮，有時(shí)也貫穿在整個(gè)制備過程中。沉淀（包括鹽析和有機(jī)溶劑沉淀)，廣義上來說也是一種濃縮方法，經(jīng)過沉淀再溶解，濃度可大大提高，但有時(shí)提取液很稀，體積又很大或結(jié)晶前除去少量溶劑，則常用其他方法濃縮。
1．蒸發(fā)法 液體在任何溫度下都在蒸發(fā)，蒸發(fā)是溶液表面的溶劑分子獲得動(dòng)能脫離液面逸向空間的過程。當(dāng)溶液受熱，液體中溶劑分子動(dòng)能增加，蒸發(fā)過程加快。蒸發(fā)的快慢和溫度、蒸發(fā)面積、液體表面積、液面蒸汽分子密度，即蒸汽壓大小有關(guān)。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓，當(dāng)液面上的溶劑蒸氣分子密度很小，經(jīng)常處于不飽和的低壓狀態(tài)，液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化逸出空間，以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此，根據(jù)上述原理，蒸氣濃縮裝置常按照加熱、擴(kuò)大液體表面積、低壓和加速空氣流動(dòng)等因素而設(shè)計(jì)的。
2．冰凍法 冰凍法也是生物大分子及其他有機(jī)化合物濃縮的一種有效方法。生物大分子在冰凍時(shí)，水分結(jié)成凍，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中。操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融解點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液，用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。
吸收法 是一種通過吸收劑直接吸收溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。使用的吸收劑必須與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物大分子不起吸附作用，易與溶液分開，吸收劑除去溶劑后能重復(fù)使用。實(shí)驗(yàn)室中最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。使用凝膠時(shí)，首先選擇凝膠粒度大小恰好溶劑及低分子物質(zhì)能滲入凝膠內(nèi)，而生物大分子卻完全排除于凝膠之外的，然后將洗凈和干燥的凝膠直接投入待濃縮的稀溶液中，凝膠親水性強(qiáng)，在水中溶脹時(shí)，溶劑及小分子被吸收到凝膠內(nèi)，生物大分子留下剩余的溶液中，離心或過濾除去凝膠顆粒，即得已濃縮的生物大分子溶液。凝膠溶脹時(shí)吸收水分及小分子物質(zhì)可同時(shí)起到濃縮及分離純化兩種作用，對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)和生物活性都沒有影響。是近年來生物化學(xué)及分子生物學(xué)日益廣泛使用的濃縮和分離方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收劑時(shí)，需先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，扎緊袋口，外加聚乙二醇復(fù)蓋，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶劑飽和后，可更換新的，直到濃縮至所需的濃度為止。用完一次以后的聚乙二醇經(jīng)過加熱除去溶劑便可再次使用。
4．超濾法 超濾法是使用一種特制的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方法。當(dāng)溶液在一定壓力下（外源氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡?通過膜時(shí)，溶液和小分子透過，大分子受阻保留于原來溶液中，其原理如圖2—2所示。這一近年發(fā)展起來的新方法是適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子生理活性、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。除去濃縮、脫鹽外，并可應(yīng)用生物大分子的分離純化，是目前民展較快且為人們所采用的生化技術(shù)之一。
圖2-2 超濾法示意圖
通過超濾法，蛋白質(zhì)和酶的稀溶液一般可濃縮到10%～15%濃度，回收率高達(dá)90%。超濾法應(yīng)用關(guān)鍵在于膜選擇。不同類型的規(guī)格的膜、水的流速（在規(guī)定壓力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量數(shù)值)等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作的需要來選用。此外，超濾裝置形式、溶質(zhì)成分及性質(zhì)、溶液濃度及粘度都對(duì)超濾的效果有一定影響。
制品濃縮到一定程度，即可貯存，如有必要可采用低溫干燥（冰干)的方法除去制品中溶劑，使之成干粉。
制品的貯存可分干態(tài)貯存和液狀貯存。但不論是何種方法貯存，都要避免長(zhǎng)期暴露在空氣中，防止微生物的污染。溫度對(duì)生物活性物質(zhì)的活性影響很大，在絕大多數(shù)情況下應(yīng)采取低溫保存。
干態(tài)儲(chǔ)藏：干燥的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數(shù)個(gè)月甚至數(shù)年沒有顯著變化。儲(chǔ)藏方法也很簡(jiǎn)單，只將干燥后的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑)密封，保持0～4℃冰箱中即可。有時(shí)為了取樣方便和避免取樣時(shí)樣品吸水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶中，每次用時(shí)，只取一小瓶。
液態(tài)儲(chǔ)藏：液態(tài)儲(chǔ)藏的優(yōu)點(diǎn)是使樣品減去干燥這一步驟，生物大分子的生理活性和結(jié)構(gòu)破壞較少，缺點(diǎn)是需要較嚴(yán)格的防腐措施，儲(chǔ)藏時(shí)間不能太長(zhǎng)。如樣品量大時(shí)封裝運(yùn)輸不方便，實(shí)驗(yàn)室常采取少量安瓿封存方法。液態(tài)儲(chǔ)藏注意事項(xiàng)如下：
樣品不能太稀，必須濃縮至一定濃度后才能封裝儲(chǔ)藏，樣品太稀時(shí)容易引起生物大分子變性作用。
一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性，此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對(duì)某些酶也具有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。
儲(chǔ)藏溫度要求較低，大多數(shù)在0℃左右冰箱保存即可，有的則要求更低溫度。但注意某些具有活性的大分子如DNA溶液低溫保存時(shí)，有宜使溶液結(jié)冰以造成其分子結(jié)構(gòu)被破壞，另也有文獻(xiàn)報(bào)道某些蛋白質(zhì)和酶在低溫中反而引起變性。故應(yīng)分別情況對(duì)待，不能一概而論。
生物大分子和各種生化制品的儲(chǔ)藏和保存，總的來說，溫度和水分是影響穩(wěn)定性的兩個(gè)重要因素，其次是各種穩(wěn)定劑的應(yīng)用是否適當(dāng)關(guān)系也很大。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，必須對(duì)各方面都加以考慮。
所提取、純化的抗原物質(zhì)，在使用前應(yīng)進(jìn)行定量測(cè)定。定量測(cè)定的方法，可根據(jù)不同的物質(zhì)，選擇合適的方法進(jìn)行。
某些分子量較小的抗原，如肽類半抗原，由于其結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，目前已有化學(xué)合成的純品供應(yīng)，不必自己去從組織中提取。化學(xué)合成是一項(xiàng)專門技術(shù)，可參閱有關(guān)書籍。
