第四部分 非特異性免疫試驗
機體抵抗病原微生物感染的免疫機制主要包括非特異性免疫與特異性免疫，其中非特異性免疫(亦稱www.med126.com固有免疫)是機體對抗病原微生物感染的第一道防線，包括：皮膚的機械阻擋作用；黏膜可分泌許多液體，如淚液、唾液、腸液等，其中含有溶菌酶可溶解和殺死細菌；正常血清中含有許多抗菌物質(zhì)，如補體系統(tǒng)、乙型溶素等，可殺死革蘭氏陰性或陽性菌；血液中的中性粒細胞和組織中的巨噬細胞對外來異物有吞噬和消化作用。非特異性免疫生來即有，作用廣泛，無專一性，不僅產(chǎn)生非特異抗感染免疫作用，而且在特異性免疫應(yīng)答過程中也起重要作用。
實驗一 溶菌酶的溶菌作用
【原理】
溶菌酶主要是由吞噬細胞合成并分泌的一種分子量約為14.7kDa的堿性蛋白質(zhì)，屬乙酰氨基多糖酶，不耐熱。由于它的高等電點(pH11.0)，能與細菌牢固結(jié)合，從而水解細菌細胞壁肽聚糖，使細菌死亡或裂解，主要作用于革蘭陽性細菌，溶菌酶還有激活補體和促吞噬作用。
溶菌酶廣泛存在于機體的淚液、唾液、痰、鼻腔分泌物及血清等體液中，檢測體液溶菌酶水平在一定程度上反映單核巨噬細胞系統(tǒng)的功能狀態(tài)。
溶菌酶的溶菌活性可通過對革蘭陽性微球菌(MicrococusLysodeikticus)的裂解作用進行測定。本實驗介紹紙片法進行唾液溶菌酶溶菌活性的測定。
【材料】
1．無菌pH6.4、1/15mol／L PBS，5N KOH溶液，溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品。
2．微球菌普通瓊脂斜面26～36h培養(yǎng)物。
3．受檢者唾液。
4．3%瓊脂(用pH6.4、1／15mol／L PBS配制)。
5．lml、5ml無菌吸管，無菌毛細吸管、平皿、無菌濾紙片(直徑4mm)、塑料小杯、小鑷子等。
【方法】
1．含微球菌瓊脂平板的制備 取無菌溶化的3%瓊脂10ml，待冷至60～70℃時加入5ml預(yù)熱的微球菌菌液，迅速混勻，傾注于無菌平皿內(nèi)，平放待凝。
2．收集唾液標(biāo)本置于塑料小杯內(nèi)。
3．溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的配制 稱取溶菌酶干粉5mg，使其溶解于0.15mol／L pH6.4磷酸鹽緩沖液5ml內(nèi)，即獲1000ug／ml溶菌酶溶液。然后將其作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40和1∶80倍比稀釋，成為每毫升含200ug、100ug、50ug、25ug和12.5ug的標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶液。
4．取濾紙片分別于標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶液，待檢標(biāo)本(唾液)和生理鹽水(陰性對照)中浸透。
5．用記號筆在含微球菌的瓊脂平板底面先做好標(biāo)記，再用小鑷子分別夾取含不同濃度溶菌酶的濾紙片及含待測標(biāo)本或?qū)φ盏募埰⌒钠劫N于瓊脂表面。
6．置平板于37℃溫箱18～24h后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)透明的溶菌環(huán)。如有，用游標(biāo)尺測量溶菌環(huán)直徑。以標(biāo)準(zhǔn)品溶菌酶的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度溶菌環(huán)直徑的均值為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)檢測樣品的溶菌環(huán)直徑，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其相應(yīng)溶菌酶濃度，乘以樣品的稀釋倍數(shù)，則可對標(biāo)本中所含溶菌酶做定量測定。
【注意事項】
1．濾紙片應(yīng)浸有足夠的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，但它們不能成滴溢出。
2．最好在每個瓊脂平板上都放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品濾紙片，可以盡量減少平板間的結(jié)果誤差。
【思考題】
1．溶菌酶的溶菌作用有何生物學(xué)意義?
2．為什么要對溶菌酶進行定量測定?
實驗二 補體參與的試驗
補體是存在于人和脊椎動物血清與組織液中一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，廣泛參與機體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)。
一、溶血素效價的測定
【原理】
小鼠或家兔等動物經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫后血清中可出現(xiàn)抗SRBC的抗體。采集免疫動物血液分離血清，即可獲得抗SRBC的抗血清。用SRBC與相應(yīng)抗血清混合時，當(dāng)有補體存在時，在一定條件下，SRBC被破壞溶解，故抗SRBC抗體又稱為溶血素。使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀釋度稱溶血素的效價。
【材料】
1．抗體 含溶血素血清(用生理鹽水1∶100稀釋)。
2．抗原 2%SRBC懸液。
3．補體 取自豚鼠新鮮血清，生理鹽水1∶30稀釋。
4．其他 37℃水浴箱、試管、吸管、生理鹽水等。
【方法】
按表4—1加入各試驗材料。
表4-1 溶 血 素 單 位 滴定單位：ml
試管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理鹽水 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
含溶血素 ↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↗棄0.5
(1∶100)血清 0.1 → 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
血清稀釋度 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 衛(wèi)生資格考試網(wǎng)1/16000 1/32000 1/64000 1/128000
補體(1∶30) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
2%SRBC 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
搖勻后置于37℃水浴箱中30min
結(jié) 果
【結(jié)果】
將各管發(fā)生溶血的情況記錄于上表“結(jié)果”一項。以“完全溶血”“不完全溶血”“完全不溶血”三個標(biāo)準(zhǔn)來判斷。完全溶血指試管中綿羊紅細胞全部被破壞，試管中的溶液呈均勻紅色，清亮透明，試管底無紅細胞沉積。不完全溶血指綿羊紅細胞部分被破壞，試管中的溶液呈紅色半渾濁，可見部分紅細胞沉于管底。完全不溶需是指沒有綿羊紅細胞破壞，試管中的溶液呈紅色渾濁，可見部分紅細胞沉于管底。第9管(對照管)必需是“完全不溶血”時前面各管的結(jié)果才有意義。使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀釋度即為溶血素的效價，若溶血素效價為1∶8000，則8000倍稀釋的溶血素為1單位。做補體結(jié)合試驗時常用0.2ml中含2個溶血素單位的稀釋液，可取1∶100的溶血素lml加生理鹽水39ml即得。
【注意事項】
1．補體的血清必須新鮮。
2．SRBC用前一定要搖勻。
【思考題】
溶血素破壞紅細胞為什么必須有補體參加？不加補體會出現(xiàn)什么結(jié)果？
二、總補體溶血活性測定(CH50測定)
【原理】
CH50測定(total hemolytic complement assay，CH50 assay)是利用補體能使溶血素致敏的綿羊紅細胞(致敏的綿羊紅細胞即綿羊紅細胞與相應(yīng)抗體形成的免疫復(fù)合物)發(fā)生溶血，當(dāng)致敏紅細胞濃度恒定時，在一定范圍內(nèi)溶血程度與補體的量及活性呈正比例關(guān)系。因此，以溶血程度為縱坐標(biāo)，補體量為橫坐標(biāo)繪圖，可得“S”型曲線（如圖4-1)，曲線兩端平坦，補體量的增減與溶血程度影響不大，而在曲線中段（50%溶血附近)曲線最陡，幾乎成一垂直線，此時補體量的細微變化可引起溶血程度的明顯改變，故取50%溶血為終點觀察指標(biāo)，即以引起50%溶血的最小血清量作為一個CH50單位。臨床上，CH50測定可用于某些超敏反應(yīng)性疾病的輔助診斷，也可作為觀察病情變化的指標(biāo)。
圖4-1 CH50測定
【材料】
1．緩沖鹽水(pH7.4)
⑴ 10×貯備液 NaCl 75g、lmol／L HCl 177ml、三乙醇胺28ml、MgCl2•6H2O 1.0g、CaCl2•2H2O 0.2g。先將NaCl溶于700ml蒸餾水中，加入HCl及三乙醇胺，MgCl2及CaCl2分別用2ml蒸餾水溶解后，逐一緩慢加入，再用蒸餾水加至1000ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
⑵ 應(yīng)用液 取1份貯備液，加9份蒸餾水，4℃保存待用。
2．2%SRBC懸液 新鮮脫纖維羊血或Alsever液保存羊血(4℃可保存3周)，生理鹽水洗2次，第3次用緩沖鹽水，離心2000rpm，10min。壓積細胞用緩沖鹽水配成2%懸液。為使紅細胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化，可將2%細胞懸液用緩沖鹽水稀釋25倍，于分光光度計(542nm)測定其透光率(以緩沖鹽水校正透光率至100%)，每次試驗用紅細胞濃度(透光率)必須一致。
3．溶血素按效價以緩沖鹽水稀釋至2單位 (如效價為1∶8000，使用時按1∶4000稀釋) 。
4．致敏SRBC 2%SRBC加等量2單位溶血素，混勻置37℃水浴10min。
5．待檢血清。
6．試管、吸管、離心機、37℃水浴箱、分光光度計等。
【方法】
1．取待檢血清0.2ml，加緩沖鹽水3.8ml，使成1∶20稀釋液。
2．取干凈試管10支，按表4—2所示加入各試劑，混勻，試管置37℃水浴30min。
3．50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管 于2ml 2%SRBC懸液中加入8ml蒸餾水，混勻，使完全溶血，然后取此液體2ml加pH7.4緩沖鹽水2ml，混勻后即為50%溶血管。
表4-2 CH50測定 單位：ml
管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1∶20稀釋血清 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 -
緩沖鹽水(pH7.4) 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 1.50
2U溶血素 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2%SRBC 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
總補體CH50(U/ml) 200 133 100 80 66.5 57.1 50 44.4 40 -
【結(jié)果】
將各試驗管經(jīng)2500rpm，5min，用肉眼找出最接近50%溶血管的試驗管后，用分光光度計(542nm，0.5cm比色杯)讀該管的A542值，即可求出補體總?cè)苎钚�。此�?shù)值即用以表示血清的總補體活性。
計算：
1
血清總補體CH50(U/ml)= × 稀釋倍數(shù)
引起50%溶血管血清量(ml)
假設(shè)第4管的光密度最接近標(biāo)準(zhǔn)管，則補體含量為1/0.25×20=80U/ml，表4-2中提供各管相應(yīng)補體含量，可不必計算而能直接查出，第10管為空白對照管，要求不溶血。
正常參考值：50～100U／ml。
【注意事項】
1．緩沖液、致敏羊紅細胞均應(yīng)新鮮配制。
2．實驗器材應(yīng)清潔。
3．待測標(biāo)本必須新鮮，應(yīng)無溶血、無污染、無乳糜血。如放置2h會使補體活性下降。
4．補體的溶血活性受多種因素的影響，如綿羊紅細胞濃度及致敏抗體的量等。鈣、鎂離子的存在可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但含量過多時，反而抑制溶血反應(yīng)。
【思考題】
1．何為CH50單位？為何取50%溶血為終點觀察指標(biāo)？
2．血清標(biāo)本放置時間長后補體活性會有何變化？
實驗三 吞噬細胞吞噬作用及吞噬殺菌功能測定
病原微生物一旦突破體表防御屏障侵入機體，首先接觸遍布全身的大、小吞噬細胞，它們分布于血液和組織中，并可在某些趨化因子的作用下被吸引至微生物侵入部位。吞噬細胞依據(jù)其形態(tài)大小分為兩大類：一類是血液中的單核細胞及由血液游走到血管外并固定于各組織中的巨噬細胞，稱為大吞噬細胞；另一類是血液中的嗜中性粒細胞稱為小吞噬細胞。它們是機體非特異性免疫的重要因素。
一、巨噬細胞的吞噬作用——大吞噬現(xiàn)象(體外法)
【材料】
1．體重25g左右的小鼠。
2．5ml、lml無菌注射器，6號、9號針頭，10ml離心管，清潔載玻片，燒杯，解剖剪，眼科鑷，濕盒，解剖板，圖釘，37℃水浴箱。
3．4%淀粉肉湯 稱面粉3克、可溶性淀粉5克、加營養(yǎng)肉湯至100ml，混勻，先微火加熱，不斷攪拌使成糊狀。再高壓滅菌。臨用時，與無菌營養(yǎng)肉湯等量混合。
4．D-Hanks液(配方見附錄)。
5．生理鹽水。
6．2%雞紅細胞 無菌操作抽取雞翅靜脈血，抗凝，置于離心管中，用無菌生理鹽水洗3次，最后一次離心2000rpm，10min，按壓積將雞紅細胞用Hanks液配成2%濃度。
7．瑞特氏染色液。
8．pH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液 20ml 1%Na2HP04，30ml 1%KH2P04，加蒸餾水至1000ml，混勻。
【方法】
1．實驗前三天給小鼠腹腔內(nèi)注射lml 4%淀粉肉湯。
2．實驗當(dāng)天給小鼠腹腔內(nèi)注射Hanks液3～4ml，輕揉腹部，讓小鼠活動10min。
3．眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，并將小鼠釘在解剖板上。
4．碘酒、酒精消毒腹部皮膚，左手持鑷提起腹中部，用解剖剪在皮膚上剪5mm長的小口，將皮膚朝頭尾部方向剝開，暴露腹壁。
5．用鑷子提起腹壁，避開血管剪一小口，用5ml注射器(帶9號針頭)或毛細吸管吸取腹腔液滴于載片上，每片2～3滴，并滴加等量的2%雞紅細胞懸液，充分混勻。
6．將玻片置于濕盒內(nèi)，放37℃水浴箱內(nèi)35～45min，期間輕晃動玻片二次。
7．取出后，將載玻片在生理鹽水中漂洗2次，洗去未吸附在玻片上的細胞。待其自然干燥。
8．用瑞特氏染色液染色
⑴ 于玻片上滴加瑞特氏染色液數(shù)滴覆蓋涂片，染色l min。
⑵ 滴加相當(dāng)于染色液1.5倍量的pH6.8磷酸鹽緩沖液(可用蒸餾水代替)于涂片上，輕搖玻片，混勻染色液，染8～10min。
⑶ 流水沖洗，印干后用油鏡觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
因巨噬細胞為貼壁生長細胞，能粘附在清潔載玻片上，故經(jīng)瑞特氏染色后，鏡下可見巨噬細胞呈橢圓形、腎形或馬蹄形，其核較大，染色質(zhì)比較疏松，染成淡紫藍色，胞漿染成淺灰藍色，如有吞噬作用發(fā)生，可見巨噬細胞胞漿中有一個以上的有核雞紅細胞。如果吞噬的雞紅細胞較多，則巨噬細胞核被擠到一側(cè)，其形態(tài)不典型。隨機計數(shù)100個巨噬細胞，分別計數(shù)吞噬有雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)和被吞噬的雞紅細胞總數(shù)。
吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)
吞噬百分率= ×100%
100個巨噬細胞
100個吞噬細胞中所吞噬的雞紅細胞數(shù)
吞噬指數(shù)= ×100%
100個巨噬細胞
此外，在計數(shù)時，應(yīng)同時注意雞RBC被消化的程度，分為4級：
I級 未消化—胞漿淺紅色或淺黃綠色、胞核淺紫紅色。
Ⅱ級 輕度消化—胞漿淺黃綠色；胞核固縮，染成紫藍色。
Ⅲ級 重度消化—胞漿淡染，胞核成淺灰黃色。
Ⅳ級 完全消化—巨噬細胞內(nèi)只見形狀似紅細胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。
吞噬百分率和吞噬指數(shù)增高，表明機體大吞噬細胞的吞噬能力強，反之則吞噬能力弱。
【注意事項】
1．所用器材要干凈。
2．越接近涂片末稍細胞數(shù)越多，故計數(shù)時應(yīng)取片子的前、中、后三段計數(shù)，以提高準(zhǔn)確性。
3．凡需要瑞特氏染色的涂片必須在空氣中自然干燥后再染色，避免加熱干燥。否則細胞因受熱脫水而皺縮，影響吞噬現(xiàn)象的觀察。
二、中性粒細胞的吞噬作用——小吞噬現(xiàn)象
（一)體內(nèi)法
【材料】
1．白色葡萄球菌菌液，將白色葡萄球菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，培養(yǎng)18～24h，用無菌生理鹽水洗下培養(yǎng)物，經(jīng)Mafaland比濁法配成3×108個細菌／ml的懸液備用。
2．清潔載玻片、無菌注射器(1m1)及6號、9號針頭。
3．無菌肉湯。
4．小鼠(雌雄隨機)體重25克左右。
5．瑞氏染色液(配制見附錄)，pH6.8磷酸鹽緩沖液(或蒸餾水)。
【方法】
1．于實驗前1h給小鼠腹腔內(nèi)注射lml肉湯，誘導(dǎo)漿液滲出。
2．用帶6號針頭的注射器向小鼠腹腔內(nèi)注射白色葡萄球菌菌液lml，讓小鼠活動。
3．分別在注射菌液30～45min后按前述方法處死并剖開小鼠并用帶9號針頭的注射器或毛細吸管抽取腹腔液涂片，自然干燥。
4．瑞特氏染色后，油鏡觀察。
【結(jié)果】
中性粒細胞的細胞核染成深紫紅色，核分2～5葉，細胞漿染成淡粉紅色，白色葡萄球菌染成深紫色。隨機計數(shù)100個中性粒細胞，分別計數(shù)吞噬有細菌的吞噬細胞數(shù)和所吞噬的細菌總數(shù)，按上述公式分別計算出吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
【注意事項】
同大吞噬現(xiàn)象。
（二)體外法
【材料】
1．3.8%枸櫞酸鈉。
2．葡萄球菌菌液。
3．清潔載玻片、無菌注射器(1m1)、6號、9號針頭及無菌肉湯。
4．瑞氏染色液，pH6.8磷酸鹽緩沖液(或蒸餾水)。
【方法】
1．自靜脈采血0.2ml，置于含3.8%枸櫞酸鈉0.2ml的小試管中，混勻，防止凝血(可抽一個人血５ml抗凝，供全小班使用)。
2．取葡萄球菌菌液0.1ml，加入上述血液中，混勻。
3．37℃靜置孵育30min，期間于15或20min時震蕩一次。
4．取出試管，用毛細管吸取白細胞層(即沉淀紅細胞的表層)，制成血膜，自然干燥。
5．瑞特氏染色后，油鏡觀察。
【結(jié)果】
同體內(nèi)法。
【注意事項】
同大吞噬現(xiàn)象。
三、中性粒細胞的殺菌功能測定
——硝基藍四氮唑(NBT)還原試驗
【原理】
中性粒細胞在殺菌過程中能量消耗聚增，耗氧量增加，葡萄糖已糖磷酸旁路代謝的活力增強，此時如加入硝基藍四氮唑(nitrobluetetra-Zolium，NBT)，葡萄糖分解的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖氧化所脫的氫可被NBT接受，NBT被還原，從淡黃色變成藍黑色，以點狀或斑塊狀顆粒沉積于胞漿中，這種細胞稱為NBT陽性細胞。鏡下檢查NBT陽性細胞數(shù)量便可推知中性粒細胞的功能，臨床上也可作慢性肉芽腫等吞噬細胞功能缺陷病的輔助診斷指標(biāo)。
【材料】
1．清潔小試管(12×100mm)，載玻片，毛細吸管。
2．肝素抗凝的人外周血。
3．生理鹽水。
4．NBT試劑 0.28%NBT生理鹽水溶液0.6ml、牛血清0.5ml、生理鹽水、0.3ml的混合液。
5．瑞特氏染色液。
6．37℃水浴箱等。
【方法】
1．滴加一滴肝素抗凝的人血標(biāo)本于清潔載玻片上，濕盒內(nèi)放置10min，在此期間中性粒細胞可粘附在載玻片上。
2．用生理鹽水輕輕沖洗玻片，沖去未粘附的細胞，并用吸水紙吸去多余的水分。
3．標(biāo)本上加1滴NBT試劑，放濕盒內(nèi)于37℃水浴反應(yīng)20min。取出載玻片，自然干燥。
4．瑞特氏染色，油鏡鏡檢。
【結(jié)果】
中性粒細胞胞漿中出現(xiàn)點狀或塊狀藍黑色沉淀物的為NBT陽性細胞。計數(shù)100個中性粒細胞，求出NBT陽性細胞百分率。百分率愈高，表明中性粒細胞的吞噬功能越強。陽性細胞百分率可作為區(qū)別細菌性與病毒性感染的指標(biāo)之一，當(dāng)機體受細菌感染時，NBT陽性細胞增多，受病毒感染時，NBT反應(yīng)一般正常。
【注意事項】
1．在吞噬試驗過程中玻片不能干，否則吞噬作用將不能進行。
2．在染色前，玻片上的標(biāo)本一定要自然干燥，不宜加熱烘干，否則細胞會固縮而影響細胞形態(tài)。
3．瑞特氏染色時染液與磷酸鹽緩沖液的比例一定要合適。
4．NBT染液用前要過濾，不要殘留顆粒。
5．所用玻片必須干凈，以避免玻璃表面雜質(zhì)參與NBT的還原作用。
【思考題】
1．為什么說吞噬細胞是機體抗感染的重要防線?如果吞噬功能喪失，對機體會有什么影響?
2．吞噬百分率與吞噬指數(shù)有何異同？
3．小吞噬實驗與NBT還原試驗意義上有什么區(qū)別？
4．為何NBT還原試驗可以區(qū)別受試者是受細菌感染還是受病毒感染?
