第七章 血液系統(tǒng)
第一節(jié) 血液凝固與抗凝
[實驗目的]
（1)學習用玻片法測定凝血時間。
（2)觀察家兔體外血凝、組織因子促凝和肝素抗凝過程，并分析各個過程度產生機制。
[實驗動物]
家兔，體重2.0～2.5kg/只，雌雄不拘。
[藥品、器材]
1． 藥品
蒸餾水、生理鹽水、3%戊巴比妥鈉溶液（或25%氨基甲酸乙酯)、1250單位/ml的低分子量肝素鈉溶液（臨用時配制)、肺組織浸液（含組織因子)。
肺組織浸液制備方法：取新鮮兔肺，剪成小塊，洗凈血液。磨成糊狀。加入3～4倍的生理鹽水，搖勻放冰箱中過夜，大濾紙過濾后，即可得肺組織浸液，保存冰箱備用。
2．器材
兔常用手術器械一套、兔臺、兔繩、玻璃分針、動脈小尼龍插管、動脈夾、縫合線、紗布；注射器：5ml注射器和7號針頭各4個
干凈、干燥的玻片：3塊標記筆1支干凈、干燥的大頭針3根多功能秒表1個水浴恒溫箱1個干凈、干燥的取血小試管1個
[觀察指標]
凝血時間測定（小時： 分鐘： 秒： )
[方法、步驟]
1．實驗前的準備
（1)打開水浴恒溫箱，灌入適量的自來水至試管架的平面，恒溫37 ℃。待用。
（2)取干凈、干燥的玻片3塊，編號，然后將玻片放入水浴恒溫箱的試管架上，加溫至37 執(zhí)業(yè)醫(yī)師℃，注意不要弄濕；
（3)動物準備
兔稱重后，用3%戊巴比妥鈉溶液1ml/kg體重（或25%氨基甲酸乙酯4ml/kg體重)麻醉，注射速度要慢；背位固定，行頸總動脈分離術和尼龍管插管術（暫不放血)。
（4)按表1中實驗的項目在玻片上分別用不同的5ml注射（安裝7號針頭)加入相應的試劑。注意不要混淆。
表7-1家兔的體外血凝、抗凝和促凝因素對凝血時間的影響
| 凝血時間（小時： 分鐘： 秒： ) |
| 1號玻片上加入肺組織浸液1滴： 2號玻片上加入生理鹽水1滴： 3號玻片上加入肝素溶液1滴： |
2．凝血時間測定和記錄時間
（1) 取干凈、干燥的小試管1個，迅速放入動脈血2ml（注意：經小尼龍管放血時，第一滴已激活的血液棄掉)；
（2)取血后，立即用5ml注射器（安裝7號針頭)抽取血液少許，并在每塊玻片的試劑上加入等量的1滴血液，在分別用大頭針混勻（注意不要混淆)的同時立刻計時（注意首先記錄1號玻片的凝血時間)。
（3) 每隔10秒，用大頭針在各玻片的血液中，朝一個方向挑血絲，見到第一個血絲的出現(xiàn)，立即終止計時。從開始計時到終止計時的一段時間即為玻片法的凝血時間。請將該時間記錄到表1中。
[注意事項]
（1)所用玻璃器皿要求干凈、干燥。
（2)專用試劑、大頭針和注射器不要混淆。
（3)計時要耐心、細心、和準確、因為第一凝血絲的出現(xiàn)是瞬間的。
（4)可利用第一節(jié)家兔的體外血凝、促凝和抗凝實驗的兔、試劑注射器，繼續(xù)做第二節(jié)家兔體內的微循環(huán)、促凝和抗凝實驗)
[思考題]
（1)比較表1中各凝血時間，為什么時間有長短？
（2)在肺組織浸液促進血凝塊出現(xiàn)后立即加入肝素溶液1滴，仔細觀察兔凝血塊是否能溶解？為什么？
第二節(jié) 急性彌散性血管內凝血
[實驗目的]
（1)觀察家兔體內腸系膜微循環(huán)的血液流動特點。
（2)觀察組織因子在家兔體內促凝過程和肝素預防組織因子在家兔體內促凝過程，并分析各個的作用機制。
[實驗動物]
家兔，體重2.0～2.5kg/只，雌雄不拘。
[藥品、器材]
1．藥品
蒸餾水、生理鹽水、3%戊巴比妥鈉溶液（或25%氨基甲酸乙酯)、低分子量肝素鈉溶液（臨用時，一支肝素溶液用生理鹽水稀釋10倍)、肺組織浸液。
2．器材
Compact-X型全自動血液凝集分析儀；BL--2000型微循環(huán)觀察儀；手術器械一套、兔臺、兔繩、玻璃分針、動脈小尼龍插管、動脈夾、縫合線、紗布，5ml注射器3個、1ml注射器1個，計時鐘。
[觀察指標]
（1)腸系膜微循環(huán)凝血時間測定（小時： 分鐘： 秒： )，計時從注射試劑開始到血流停止為止。凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、 凝血酶時間(TT)/ 爬蟲酶時間、 纖維蛋白原(FIB)、凝血因子濃度(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)、抗Ⅹa因子肝素檢測、D二聚體。
（2)呼吸頻率（次/分)
（3)嘴唇、黏膜的發(fā)紺情況
[方法、步驟]
1．家兔腸招生簡章系膜微循環(huán)暴露手術
在兔右腹側部（近兔臺處)作一平行于兔身體縱軸的約2cm長的切口，打開腹腔，輕輕拿出一小段小腸，找出腸系膜的透明部分，將其置于低倍顯微鏡下，找到微循環(huán)血液流速很快的部分，并在高倍鏡下進一步找到含有數(shù)根僅有單個細胞通過的毛細血管的腸系膜，固定該視野，以便觀察其變化。（用濕潤的生理鹽水紗布輕輕蓋在腸系膜上)
2．續(xù)用第一節(jié)實驗的兔三只，分別編號1、2、3。做以下實驗：
（1) 注射生理鹽水組：在2min內給1號兔緩慢靜脈注射生理鹽水4 ml；
（2) 肺組織浸液促凝組：在2min內給2號兔緩慢靜脈注射生理鹽水2 ml和肺組織浸液2ml；
（3) 肝素溶液抗凝組： 在2min內給3號兔緩慢靜脈注射肝素溶液2mlml肺組織浸液2ml。
表7-2家兔的體內血凝、促凝和抗凝因素對凝血時間、呼吸及發(fā)紺的影響的結果記錄
| 凝血時間（小時： 分鐘： 秒： ) | 呼吸（次/分)、發(fā)紺
|
| 生理鹽水組 肺組織浸液促凝組 肝素溶液抗凝組 |
[注意事項]
（1)手術中要注意及時止血。
（2)微循環(huán)觀察部分不能移動、不能人為損傷和出血。
[思考題]
（1)比較三組的微循環(huán)情況，是否都有凝血？為什么？
（2)在肺組織浸液促凝組凝血后立即緩慢注射注射肝素溶液2ml，仔細觀察兔腸系膜微循環(huán)凝血情況是否能改善？為什么？
（3)在肺組織浸液促凝組凝血后若兔繼續(xù)存活，仔細觀察1～3小時后兔腸系膜微循環(huán)是否發(fā)生多處毛細血管壁破裂、出血現(xiàn)象即彌漫性血管內凝血（DIC)現(xiàn)象。DIC 怎樣預防？
第三節(jié) 血藥濃度半衰期測定
［實驗目的］
（1)掌握t1/2比色測定法。（2)了解藥物血漿A（t1/2)、生物利用度和表觀分布容積等概念。
（3)學會繪制藥物時—量曲線。
[實驗動物］
家兔，性別不拘。
［藥品、器材］
723型分光光度計、離心機、手術器械一套、注射器、2號注射針頭、動脈插管、動脈夾、微量定量移液管、試管架、大號試管、吸管、洗耳球。
3％戊巴比妥鈉、125單位/ml 肝素生理鹽水、20％磺胺嘧啶鈉（SD)、6％三氯醋酸、0．5％亞硝酸鈉、0．5％麝香草酚氫氧化鈉溶液。
［觀察指標］
吸光度值。
［方法、步驟］
1．標準曲線的制備。
（1)SD標準液配制，按下列步驟：
a．取20％SD溶液2．56毫升置于200毫升容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此濃度即128mg／100m1。
b．取上清液7．5m1用蒸餾水稀釋至10m1。這時SD的濃度96mg／100m1。
c．取濃度為128mg／100m1SD溶液100ml倍稀釋分別獲得64mg／100m1、32mg／100m1、16mg／l00m1、8mg／100m1SD溶液。
（2)取試管7支，編號。每支試管內加6％三氯醋酸7．8ml，再分別加入不同濃度的SD標準液０．2m1(6支內)，另1支加入0．2mI蒸餾水。貼上標簽、混勻。
（3)再取試管7支，編號。按表7—1依次加入各種溶液后充分搖勻。
（4)用721型分光光度計比色，選擇520nm波長，讀出各試管光密度。
（5)以SD深度為橫坐標，光密度為縱坐標作標準曲線。
2．血標本制備：取家兔一只，稱重，用3％戊巴比妥鈉1ml／kg耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后固定，施頸部切開術，頸總動脈插管以備放血時用。耳緣靜脈注射0．5％肝素1m1／kg，5分鐘后放血0.5m1，同時注入20％SD溶液2m1／kg。分別于給藥后的第0、5、10、20、30、40、60分鐘時放血0.5m1。
取離心管8支，加入6％三氯醋酸7．8m1，然后從0．5m1各血樣本中準確吸取0.2ml于離心管，混勻，離心(1500轉，5分鐘)，分別取上清液于另外8支試管中，待用。
2． 比色測定
3． 按表7—2進行。
表7-3 標準曲線的制備
| 7 空白 | 6 （8mg/ 100ml) | 5 (16mg/ 100ml) | 4 (32mg/ 100ml) | 3 (64mg/ 100ml) | 2 (90mg/ 100ml) | 1 (128mg/ 100ml) | |
| ②步中標準液（ml) ②步中蒸餾水（ml) 0.5%亞硝酸鈉（ml) 0.5%麝香草酚（ml) | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 | 3 1 2 |
表7-4
| 空白管 | 待測管 | |
| 給藥前上清液(m1) 給藥后上清液(m1) 0.5％亞硝酸納(m1) 0.5％麝香草酚(m1) | 3 1 2 | 3 1 2 |
用723型分光光度計進行比色，選擇520nm波長，讀出吸光度(A)值。將結果填入表6-3
表7-5給藥后不同時間兔血SD濃度
| 0′ | 5′ | 10′ | 20′ | 30′ | 40′ | 60′ | |
| 光密度(A) 濃 度(C) 濃度對數(shù)(lgC) |
要求： 1．以時間為橫坐標，血藥濃度的對數(shù)為縱坐標，繪制t—lgc曲線。
2．從t—lgc曲線上取兩點，按下式計算出SD的血漿濃度半衰期：
t1/2= 0.301
(lgC1—lgＣ2)/Δt
3．按下式計算表觀分布容積：
Vd = A(mg)
Co(mg／ml)
4．按下式計算生物利用度：
F＝ 吸入體循環(huán)藥量
給藥總量×100%
［注意事項］
1．給SD時一定要注入靜脈內，若注射至皮下將會影響t1／2測定。
2．每次取血前先將插管中殘血放掉。
3．每吸取一個血樣時，必須更換吸嘴。
4．操作程序不得顛倒，每次加試劑后必須混勻。
5．采血時間不準時，應記錄實際時間。
6．血液加到裝三氯醋酸試管內立即振搖，否則易出現(xiàn)凝血塊。
［思考題］
1．試述t1／2、Vd、F的定義和意義。
2．某藥的最低有效血濃度為2．0mg/100m1，t1／2為10.7小時。測得患者血藥濃度4.7mg/100m1，試問尚能保持有效濃度幾小時?(計算公式Ct＝Co×0.5t/t1 / 2)
（謝志忠 廖端芳)
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凝血前 凝血后