致畸作用是發(fā)育毒性中最重要的一種表現(xiàn)，所以外來(lái)化合物發(fā)育毒性的評(píng)定，主要是通過(guò)致畸試驗(yàn)。在致畸試驗(yàn)中除可觀察到出生幼仔畸形外，也可同時(shí)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和胚胎致死。傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)是評(píng)定外來(lái)化合物是否具有致畸作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，多年來(lái)很多國(guó)家和機(jī)構(gòu)都采用和推薦這一方法。 （一)傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(yàn)（致畸試驗(yàn)) 1．動(dòng)物選擇 致畸試驗(yàn)的動(dòng)物選擇，除參照毒性試驗(yàn)中選擇動(dòng)物的一般原則，即食性和對(duì)受試物代謝過(guò)程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價(jià)廉外，還應(yīng)特別注意妊娠過(guò)程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點(diǎn)。 根據(jù)上述原則綜合考慮，致畸試驗(yàn)可選用二種哺乳動(dòng)物，一般首先考慮大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窩產(chǎn)仔8～10只，易于得到足夠標(biāo)本數(shù)；而且經(jīng)驗(yàn)證明，大鼠對(duì)大多數(shù)外來(lái)化合物代謝過(guò)程，基本與人類近似，故可首先考慮。但大鼠對(duì)一般外來(lái)化合物代謝速度，往往高于小鼠和家兔，以致對(duì)化學(xué)致畸物耐受性強(qiáng)、易感性低，有時(shí)出現(xiàn)假陰性。大鼠在器官發(fā)生期初期，其胎盤具有卵黃囊，稱為卵黃囊胎盤，在器官發(fā)生期后期，將轉(zhuǎn)變?yōu)榻q膜尿囊胎盤，有些外來(lái)化合物，例如錐蟲藍(lán)可以干擾通過(guò)卵黃囊胎盤對(duì)胚胎的正常營(yíng)養(yǎng)過(guò)程，并因此致畸，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果；而人類胎盤不具有卵黃囊胎盤階段，不存在同樣問題，所以有時(shí)此種結(jié)果對(duì)人類為假陽(yáng)性。 小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高，但低于家兔，對(duì)形成腭裂的致畸物更較敏感。家兔為草食動(dòng)物，與人類代謝功能差異較大，妊娠期不夠恒定，有時(shí)延長(zhǎng)至36天，自然畸形發(fā)生率也較高。 2．劑量分組 由于致畸作用的劑量效應(yīng)（反應(yīng))關(guān)系曲線較為陡峭，斜率較大，最大無(wú)作用劑量與引起胚胎大量死亡以及母體中毒死亡的劑量極為接近。因此在確定劑量時(shí)，一方面要求找出最大無(wú)作用劑量以及致畸閾劑量；同時(shí)還要保持母體生育能力，不致大批流產(chǎn)和過(guò)多胚胎死亡；較多母體死亡也應(yīng)避免。 一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試，預(yù)試的目的是找出引起母體中毒的劑量。 根據(jù)預(yù)試結(jié)果可以確定正式試驗(yàn)劑量。應(yīng)最少設(shè)3個(gè)劑量組，另設(shè)對(duì)照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過(guò)10%。最低劑量組不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級(jí)數(shù)關(guān)系。 一般最高劑量不超過(guò)LD50的1/5～1/3，低劑量可為1／100～1／30。這一原則在預(yù)試中也可試用。如已掌握或能估計(jì)人體實(shí)際接觸量，也可將實(shí)際接觸量作為低劑量，并以其10倍左右為最高劑量。凡急性毒性較強(qiáng)的受試物，所采用劑量應(yīng)稍低，反之可較高。也有人以亞慢性毒性試驗(yàn)的最大無(wú)作用劑量為高劑量，并以其1／30為低劑量，可供參考。 每組動(dòng)物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動(dòng)物3～4只。在一般常規(guī)試驗(yàn)中，除設(shè)有3個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組外，如受試物溶于某種溶劑或介質(zhì)中給予動(dòng)物，則另設(shè)溶劑對(duì)照組。有時(shí)為了更好地驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，按大鼠每kg體重15 000IU維生素A劑量，或?qū)⒚縨l含50 000IU維生素A的濃魚肝油，按每100g體重1 ml劑量給大鼠灌胃。此外敵枯雙、五氯酚鈉等也可采用。 3．動(dòng)物交配處理 將性成熟雌雄動(dòng)物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機(jī)分入各劑量組和對(duì)照組。確定受孕方法是陰栓檢查或陰道涂片精子檢查。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。準(zhǔn)確確定受孕日對(duì)精確掌握動(dòng)物接觸受試物時(shí)間、最后處死動(dòng)物及確定進(jìn)行檢查的日期非常重要。 由于致畸作用有極為明確的敏感期，應(yīng)精確掌握動(dòng)物接觸受試物的時(shí)間，必須在器官發(fā)生期。如提前在著床前接觸，將影響受精卵的著床。如在胚胎發(fā)育的最初階段，例如裂卵期和囊胚期接觸受試物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官發(fā)生期以后接觸受試物，則各種器官已發(fā)育成熟，致畸作用不易表現(xiàn)。只有器官發(fā)生期的胚胎，對(duì)致畸物最為敏感，易于出現(xiàn)畸形。 大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始給予受試物，每日一次，持續(xù)到第15天。如擬深入研究何種器官對(duì)受試物更為易感，則應(yīng)在上述期間將受試物每日分別給予一批動(dòng)物，每批動(dòng)物只接觸受試物一次，最后可以根據(jù)畸形出現(xiàn)的情況，確定受試物的主要靶器官。 接觸受試物的方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致，一般多經(jīng)口給予。也可采用灌胃方式，以保證劑量準(zhǔn)確，效果較混入飼料喂給為好。在特殊情況下，也可采用腹腔注射法，效果與經(jīng)口近似。 試驗(yàn)期間每2～3天稱取母鼠體重。一方面可根據(jù)體重增長(zhǎng)，隨時(shí)調(diào)整給予受試物的劑量，同時(shí)也可觀察受孕動(dòng)物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕動(dòng)物的體重如持續(xù)增長(zhǎng)，則表示妊娠過(guò)程及胚胎發(fā)育正常；如體重停止增長(zhǎng)或下降，可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因，引起胚胎死亡或流產(chǎn)。 4．胎仔檢查 自然分娩前1～2日將受孕動(dòng)物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。 活產(chǎn)胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計(jì)算平均體重，然后由下列幾方面進(jìn)行畸形檢查：①外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；②肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；③骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等�；螜z查只限活產(chǎn)胎仔。 以上檢查只能檢出結(jié)構(gòu)與形態(tài)異常的畸形，不能檢出可能發(fā)生的生化功能或神經(jīng)行為缺陷。因此有人主張將試驗(yàn)雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并將出生幼仔飼養(yǎng)觀察，至少到斷奶，以便檢查可能存在的先天缺陷和生理功能異常。 5．結(jié)果評(píng)定 在致畸試驗(yàn)結(jié)果評(píng)定時(shí)，主要計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。計(jì)算畸胎總數(shù)時(shí)，每一活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個(gè)畸胎。計(jì)算畸形總數(shù)時(shí)，在同一幼仔每出現(xiàn)一種畸形，即作為一個(gè)畸形；如出現(xiàn)二種或二個(gè)畸形，則作為二個(gè)畸形計(jì)，并依此類推。計(jì)算時(shí)還要對(duì)劑量效應(yīng)（反應(yīng))關(guān)系加以分析。更重要的是按下列指標(biāo)將各劑量組與對(duì)照組結(jié)果進(jìn)行比較。 （1)活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)： 即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計(jì)算每個(gè)活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)。對(duì)較為重要的畸形，還可分別單獨(dú)進(jìn)行計(jì)數(shù)。 畸形總數(shù) 活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)= ——————————— 活產(chǎn)幼仔總數(shù) （2)畸形出現(xiàn)率：即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。 出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù) 畸胎出現(xiàn)率= ——————————— × 100% 活產(chǎn)胎仔總數(shù) （3)母體畸胎出現(xiàn)率：即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。計(jì)算出現(xiàn)畸形母體數(shù)時(shí)，同一母體無(wú)論出現(xiàn)多少畸形胎仔或多少種畸形，一律按一個(gè)出現(xiàn)畸胎的母體計(jì)算。 出現(xiàn)畸胎的母體數(shù) 母體畸胎出現(xiàn)率= ———————————× 100% 妊娠母體數(shù) 6．致畸物以及發(fā)育毒性作用物危險(xiǎn)度評(píng)定 （1)歐共體（EEC)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD)建議的致畸物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。主要根據(jù)動(dòng)物試驗(yàn)和人群調(diào)查資料，具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)： 1級(jí)， 已確定人類母體接觸后可引起子代先天性缺陷； 2A級(jí)，對(duì)動(dòng)物肯定致畸，但對(duì)人類致畸作用尚未確定因果關(guān)系； 2B級(jí)，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果肯定致畸，但無(wú)人類致畸資料； 3 級(jí)，尚無(wú)結(jié)論性肯定致畸證據(jù)或資料不足； 4級(jí)， 動(dòng)物試驗(yàn)陰性，人群中調(diào)查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)致畸 （2)致畸指數(shù)： 母體LD50與胎仔最小致畸作用劑量之比，即母體LD50／胎仔最小致畸作用劑量。這一比值愈大，致畸作用愈強(qiáng)，一般認(rèn)為比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用強(qiáng)烈。 （3)相對(duì)致畸指數(shù)（RTI)：成年動(dòng)物最小致死劑量（LD01)與引起5%活產(chǎn)胎仔出現(xiàn)畸形的劑量（tD05)之比值，即LD01／ LD05。 （4)母體毒性與發(fā)育毒性比值：或稱成年毒性與發(fā)育毒性比值，即對(duì)母體最低損害作用劑量（A)與胎仔最低損害作用劑景（D)之比（A／D)。一般認(rèn)為A／D比值為3或3以上者，則具有發(fā)育毒性危險(xiǎn)性。比值越大，危險(xiǎn)性越高，3以下者，相對(duì)危險(xiǎn)性較低或不具危險(xiǎn)性。在一般情況下，大多數(shù)化合物A／D比值均在3以下，以及1～2范圍內(nèi)。關(guān)于母體和胎仔最低損害作用的具體表現(xiàn)，在母體主要為體重增長(zhǎng)減少，出現(xiàn)某些臨床癥狀以及死亡，對(duì)胎仔則為致畸以及其它發(fā)育毒性表現(xiàn)。 | 
