實(shí)驗(yàn)十九 乙型肝炎病毒的微生物學(xué)檢查
侵犯人體肝臟并致病的肝炎病毒主要有5種，即甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV，或稱δ因子)和戊型肝炎病毒(HEV)。HBV屬于一類獨(dú)特的嗜肝病毒(hepadnaviruses)，引起人類乙型肝炎。
通過(guò)電鏡可直接查找血清中的HBV，通過(guò)核酸分子雜交可檢查HBVDNA。而檢測(cè)HBV抗原抗bhskgw.cn/wsj/體的血清學(xué)試驗(yàn)已普遍開展，本實(shí)驗(yàn)著重介紹HBsAg等的檢測(cè)，其他抗原抗體的檢測(cè)方法與此類似，從略。
一、HBV的免疫電鏡檢查
通過(guò)簡(jiǎn)易快速的免疫電鏡技術(shù)(simpleand rapid immune electron microscopy)，SRIM)檢測(cè)HBV。
【材料與方法】
1．Ag-Ab復(fù)合物的制備 將0.1～0.5ml純化的HBsAg與0.01～0.05ml適當(dāng)稀釋的抗體(視其抗體效價(jià)定，一般用1/10)混勻，置37℃水浴30min。
2．濃縮復(fù)合物 在2～3層濾紙上放1塊厚0.15cm，2.5cm2的1%瓊脂糖鹽水凝膠塊，加1滴Ag-Ab復(fù)合物在凝膠上呈水珠狀，然后將帶有載膜(噴有炭)的電鏡銅網(wǎng)倒扣漂浮于液滴上。
3、磷鎢酸(PTA)負(fù)染 在液滴吸干前用鑷子小心取下銅網(wǎng)，面向上置于載玻片上，立即加1滴2%PTA溶液(pH6.5～7.0)，染色1～2min。用濾紙小心吸干多余染液后，立即用電鏡觀察。
4、電鏡觀察 在5000～10000倍下，尋找有復(fù)合物的部位。然后轉(zhuǎn)高倍觀察并照相。
【結(jié)果】
可在成堆的復(fù)合物中觀察到免疫“橋”和HBV顆醫(yī)學(xué)三基粒，可見球形或管形等特有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
二、HBsAg的檢測(cè)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是目前檢測(cè)HBsAg最常用的方法。
【原理】
采用雙抗體夾心法。將特異性抗-HBs吸附于固相載體表面，與加入待檢血清中的相應(yīng)HBsAg結(jié)合為Ag-Ab復(fù)合物，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-HBs酶結(jié)合物，有酶相應(yīng)底物存在情況下，產(chǎn)生顏色變化，用肉眼判讀或酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。
【材料】
1．包被液 0.02MpH9.6的碳酸鹽緩沖液。
2．洗滌液 0.02M pH7.4的PBS-Tween 20(0.05%)液。
3．酶結(jié)合物 用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-HBs。
4．酶抗體稀釋液 0.01M pH7.4的PBS-Tween20液。
5．酶底物液 鄰苯二胺(OPD)10mg溶于pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液25ml中，臨用前加入30%H2O2 0.12ml。新鮮配制，避光。
6．終止液 2MH2SO4。
7．待檢血清、陽(yáng)性血清、陰性血清。
8．聚苯乙烯微量板、微量移液器、吸頭等。
【方法】
1．包被 用包被液稀釋抗-HBs為50μg/ml，加入微量板100μl/孔。置4℃過(guò)夜后，用洗滌液洗3次，每次3～5min。
2．加樣 加入稀釋為1/50的待檢血清100μl/孔，每個(gè)標(biāo)本作2孔，同時(shí)作陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，置37℃2h洗滌3次。
3．加酶結(jié)合物 加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶結(jié)合物100μ1/孔，置37℃2h洗滌3次。
4．加底物 100μl/孔，避光置37℃20～30min。
5．終止反應(yīng) 1滴/孔終止液。
【結(jié)果】
肉眼判讀時(shí)，待測(cè)孔顏色與陰性對(duì)照一樣或更淺，判為陰性。若明顯加深，呈黃棕色，判為陽(yáng)性。用酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)，可選擇單波長(zhǎng)450nm(以空白孔校零)或雙波長(zhǎng)450/630nm，讀取各孔OD值。P/N值≥2.1為陽(yáng)性，<2.1為陰性。P為被檢標(biāo)本OD值，N為陰性對(duì)照OD值。陰性對(duì)照OD值低于0.05作0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。
【注意事項(xiàng)】
1．包被后的板，可用0.5～l.0%牛血清白蛋白封板，能更好避免非特異反應(yīng)出現(xiàn)。
2．微量板包被洗滌液吸干后，4℃干燥保存,可在3個(gè)月內(nèi)使用。
3．加入待檢血清與酶結(jié)合物后，置43℃1h或4℃18～22h與37℃2h效果一樣。
4．若用pH9.0的Tris-Tween洗滌液，效果優(yōu)于pH7.4的PBS洗滌液。
5．配制底物液宜用棕色瓶，微量板加入底物后注意避光。
