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2.2.3 SDS-PAGE 分析hA21 聚集的性質(zhì)
分離膠濃度為8%，將經(jīng)S300 分子篩層析柱分離的每個(gè)峰收集，濃縮后進(jìn)行電泳檢測(cè)，以上柱前的抗體作為對(duì)照，考馬斯亮藍(lán)R-250 染色顯示蛋白條帶。
2.2.4 間接E LISA 分析hA21 不同聚集形式的抗原結(jié)合活性
用高表達(dá) ErbB2 的T6-17 細(xì)胞裂解液包被96 孔酶標(biāo)板2 h，不表達(dá)ErbB2 的3T3 細(xì)胞裂解液為陰性對(duì)照。PBS-T 洗3 次，每次2 min，封閉劑（含1%脫脂奶粉的PBS-T)封閉1h，PBS-T 洗3 次，然后把S300 分離的各個(gè)峰以原液加到板上，振蕩反應(yīng)1 h，清洗后加入HRP 標(biāo)記的羊抗人F 多抗反應(yīng)1 h，最后用OPD 底物顯色，檢測(cè)在490 nm 的吸收值。
2.2.5 HPSE 和間接ELISA 比較溫度、甘露醇對(duì)抗體聚集程度和活性的影響
將純化后的抗體濃度調(diào)整為1 mg/mL，甘露醇的加入量與抗體的質(zhì)量濃度比為20:1，對(duì)照組加入等體積緩沖液，將兩組都分別放置于4和37過(guò)夜。用HPSE S300 進(jìn)行分析，樣品量均為30 μL，用儀器自帶軟件采用面積歸一法計(jì)算每種條件下各個(gè)峰所占比例醫(yī).學(xué).全.在.線bhskgw.cn，每種樣品測(cè)三次取平均值。間接ELISA 檢測(cè)不同溶液環(huán)境下抗體結(jié)合活性變化（抗體濃度均稀釋為1 ng/μL)。
2.2.6 圓二色譜（D)分析抗體構(gòu)象變化
遠(yuǎn)紫外光譜分析樣品濃度為0.1 mg/mL，樣品池容積為0.4 mL，從200-250 nm 每1 nm為一個(gè)測(cè)量值，近紫外光譜分析樣品濃度為1 mg/mL，樣品池容積為3 mL，從250-450 nm每1 nm 為一個(gè)測(cè)量值。以相應(yīng)溶液為空白對(duì)照，掃描速度為100 nm/min，根據(jù)樣品設(shè)置不同的水浴溫度，結(jié)果取同一樣品3 次掃描的平均值。
2.2.7 抗體的酶解分離以及聚集部位的分析
抗體置于 pH 7.0 的0.02 mol/L 的磷酸鹽溶液中（含0.01 mol/L EDTA)，用木瓜蛋白酶酶解過(guò)夜，將酶解液用Protein A 親和柱進(jìn)行分離純化，掛柱后洗脫下來(lái)的是含為抗體恒定區(qū)（F 段)的部分，未掛柱的為不含F(xiàn) 段的部分。將未掛柱的成分用Superdex G75 進(jìn)一步精細(xì)純化得到抗體可變區(qū)（單鏈抗體sFv)，保存于0.02 mol/L 醋酸鈉溶液中（pH 5.5，0.2 mol/L Nal)，將純化所得的sFv（濃度約0.2 mg/mL)同樣用HPSE S300 進(jìn)行分析。
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 高效排阻色譜(HPSE)對(duì)抗體hA21 聚集現(xiàn)象的鑒定
純化后的抗體經(jīng)HPSE S300 分離出現(xiàn)連續(xù)的三個(gè)峰，出峰時(shí)間分別為14.36min、15.37 min 和16.92 min，根據(jù)出峰時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照得出三個(gè)峰的分子量約分別為300 kD、200 kD 和100 kD，已知hA21 的單體分子量為105 kD 左右，因此這三個(gè)峰應(yīng)該分別為抗體的三聚、二聚和單體形式，采用面積歸一法得出峰1、峰2、峰3 分別占14.5%，22.6%以及62.9%。
