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3.2 動(dòng)態(tài)光散射（DLS)對(duì)聚集現(xiàn)象的鑒定
X 軸顯示散射顆粒的粒徑分布情況，Y 軸顯示各粒徑顆粒的散射光強(qiáng)度百分比（以最強(qiáng)的散射光強(qiáng)度作100%)，溶液中同時(shí)存在粒徑約為4.8 nm 和11.2 nm 的兩種不同大小的顆粒，分別占約92.5%和7.5%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道天然IgG 的粒徑大小約10 nm 左右，因hA21 的分子量?jī)H為天然抗體的2/3，所以推測(cè)4.8 nm 應(yīng)該代表hA21 抗體的單體形式，11.2 nm 應(yīng)該是代表抗體的二聚或更高形式的聚集體。
3.3 SDS-PAGE 和間接ELISA 對(duì)聚集性質(zhì)的鑒定
SDS-PAGE 結(jié)果顯示，經(jīng)HPSE 分離的三個(gè)峰和分離前的hA21 具有相同的電泳遷移率，表觀分子量都約為150 kD，為抗體的單體形式，說(shuō)明聚集體是通過(guò)非共價(jià)鍵的相互作用而形成。間接ELISA 結(jié)果顯示收集的三個(gè)峰都具有抗原結(jié)合活性（圖4b)。綜合兩者，表明hA21 具有可逆的聚集性質(zhì)。
3.4 HPSE 檢測(cè)溫度和添加劑對(duì)聚集程度的影響
與4 溶液組中單體比例（63.9%)相比，4 加甘露醇組（64.1%)、37 溶液組（65.5%)單體比例均略有增加，提示加入甘露醇、升高溫度可促使抗體解聚；而37 加甘露醇組單體比例增加較多（79.1%)，提示溫度升高同時(shí)含甘露醇的條件下抗體解聚更明顯。
3.5 間接ELISA 比較溫度和添加劑對(duì)抗體結(jié)合活性的影響
比較上述保存條件下相同濃度抗體活性變化，在4 時(shí)不同的溶液環(huán)境對(duì)抗體活性無(wú)明顯影響，但在37 時(shí)結(jié)合活性增強(qiáng)，且此溫度下含甘露醇組活性增加較明顯，提示溫度升高、含甘露醇時(shí)可增加抗體結(jié)合活性。
3.6 圓二色譜（D)分析抗體構(gòu)象變化
蛋白聚集有可能引起構(gòu)象的改變甚至導(dǎo)致變性，通過(guò)圓二色譜可對(duì)抗體的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合圖5 結(jié)果選取聚集程度變化較大的兩種情況作為代表，即保存在4加有甘露醇和保存在37加有甘露醇的兩組樣品。遠(yuǎn)紫外光譜可提示抗體二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)信息醫(yī).學(xué).全.在.線bhskgw.cn，217 nm 處的負(fù)峰代表著大量的β-折疊結(jié)構(gòu)的存在， 兩組樣品的光譜幾乎一致，符合抗體結(jié)構(gòu)含有大量β-折疊特點(diǎn)；近紫外光譜可提示抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)信息，具有292 nm 處的正值峰（和色氨酸有關(guān))以及260 nm-290 nm 處的幾處負(fù)值峰（和酪氨酸、苯丙氨酸有關(guān))，并且二硫鍵的變化信息反映在整個(gè)近紫外D 譜上，顯示和遠(yuǎn)紫外光譜相比，兩組樣品的近紫外光譜差異略大，提示不同聚集情況下抗體可能主要涉及三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。但總的來(lái)說(shuō)，不同保存條件下抗體的二級(jí)構(gòu)象和三級(jí)構(gòu)象基本保持穩(wěn)定。
3.7 分析抗體的聚集部位
將抗體酶解片段單鏈抗體（sFv)用HPSE S300 進(jìn)行分析，三個(gè)峰的出峰時(shí)間分別為18.3 min，19.1 min 和20.0 min，對(duì)應(yīng)的分子量約75 kD 、50 kD 和25 kD，分別代表sFv 的三聚、二聚和單體形式，即在相同的溶液環(huán)境中sFv 存在著與完整抗體相似的聚集趨勢(shì)，說(shuō)明聚集部位可能主要位于抗體的可變區(qū)。
