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1 材料與方法
1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物采用健康孕期15d孕鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;鹽酸Lig注射液為哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO) 、L多聚賴氨酸、阿糖胞苷為美國Sigma公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青有限公司產(chǎn)品;6孔板/Ⅱ96孔板為丹麥Costar公司產(chǎn)品;乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Olympus倒置相差顯微鏡(日本)，CO2培養(yǎng)箱(NAPCO公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIOTek公司)，兔抗大鼠AchE抗體(1∶1000)、羊抗兔IgG(1∶200)、ABC及DAB顯色試劑盒(美國VECTOR公司)。
1.2 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)[2] 健康孕15d的SD大鼠，麻醉后無菌條件下取胎鼠腦，解剖顯微鏡下取出的雙側(cè)海馬，去除腦膜和血管，2.5g/L胰酶37℃消化10min，用完全培養(yǎng)基(90% DMEM+10% FBS)終止消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度接種于多聚賴氨酸包被的24孔/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于50mL/L CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，以后每周換液2次，每次換1/2培養(yǎng)液。培養(yǎng)至神經(jīng)元分化完全后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3 海馬神經(jīng)元Glu損傷模型的建立及分組[3] 海馬神經(jīng)元按上法培養(yǎng)7d后，去除原來培養(yǎng)基，用Lockes液(154mmol/L NaCl、5.6mmol/L KCl、 3.6mmol/L NaHCO3、2.3mmol/L CaCl2、5.6mmol/L Glucose、5mmol/L HEPES，pH 7.4)洗滌細(xì)胞3次，每次5min。谷氨酸損傷組，以Lockes液配制1mmol/L Glu 20～22℃作用于培養(yǎng)細(xì)胞20min，撤除Glu，用Lockes液洗滌細(xì)胞3次，每次5min，重新加入原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h。實(shí)驗(yàn)組用Lockes液含有1mmol/L Lig加入細(xì)胞中培養(yǎng)12h后，再加入Glu作用20min。對照組Lockes液無Glu和Lig。
1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 海馬神經(jīng)元按上法培養(yǎng)7d后，除去培養(yǎng)液，用0.01mol/L PBS洗滌一次，加入40g/L多聚甲醛，室溫下固定1h，去除固定液，用0.01mol/L PBS室溫下洗滌10min，共3次。用含50mL/L羊血清、含1mL/L Triton X100的PBS液在37℃條件下封閉30min，去除封閉液。滴加一抗(rabbit antiACh monoclonal antibody，1∶1000)，4℃放置過夜，PBS洗。滴加二抗(goat antirabbit IgG, 1∶200 )，室溫放置2h，PBS洗。實(shí)驗(yàn)中設(shè)不加一抗的空白對照組，除以PBS代替一抗外，其余步驟同上。DAB顯色，顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件行細(xì)胞灰度值檢測，每張爬片隨機(jī)取5個視野，每個視野隨機(jī)取10個細(xì)胞，取其平均值醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站bhskgw.cn。
1.5 MTT法檢測海馬神經(jīng)元的活性 各實(shí)驗(yàn)組每孔加10μL MTT(5g/L)放入37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。然后每孔加人100μL濃度為200mg/L SDS，繼續(xù)培養(yǎng)12h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570nm的吸光度。每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)8個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。吸光度比值代表細(xì)胞活力。以空白對照組作為參照，其細(xì)胞生長率為100%。各組生長率=(各組吸光度值/空白對照組吸光度值)×100%。
1.6 乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定 收集培養(yǎng)基上清液，剩余培養(yǎng)液-20℃冰箱凍存7h之后，解凍，按試劑盒說明分別測定原上清液LDH的活性和培養(yǎng)板中剩余培養(yǎng)液凍溶后的LDH活性，計算LDH漏出率。
LDH漏出率(%)=上清液LDH活性/(凍溶后細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性+上清液LDH活性)×100%
1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。以P<0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)2h大部分細(xì)胞己經(jīng)貼壁生長，此時可見少數(shù)神經(jīng)元伸出1～2個突起。培養(yǎng)至2d突起增多，但神經(jīng)元突起的聯(lián)絡(luò)較少。培養(yǎng)7d時，神經(jīng)元胞體呈橢圓形或三角形，胞體周圍光暈明顯，反光均勻一致，立體感強(qiáng)，神經(jīng)元突起的主干和分支明顯延長、增粗，相互聯(lián)系增多(圖1)。
