醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:細(xì)胞間黏附分子1在紅霉素抗炎機(jī)制中的作用

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)(美國(guó)加州大學(xué))由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)體系6～10 ml，細(xì)胞密度1～2×106/ml接種于50 ml培養(yǎng)瓶，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%時(shí)隨機(jī)分為8組：①空白對(duì)照組，②TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，③EM(0.3 μg/ml，24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，④EM(3 μg/ml，24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑤EM(30 μg/ml，24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑥EM(0.3 μg/ml，48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑦EM(3 μg/ml，48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組，⑧EM(30 μg/ml，48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml，16 h)組醫(yī).學(xué).全.在.線bhskgw.cn。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT�睵CR)

1.3.1 提取細(xì)胞總RNA(按Trizol說(shuō)明書) 取1 ml內(nèi)含1×106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液于1.5 ml Eppendorf離心管中，4℃，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入1 ml Trizol分離試劑，用移液器吸頭吸打重懸細(xì)胞沉淀，室溫孵育5 min。加入0.2 ml氯仿，振搖15 s，室溫孵育10 min。4℃，13 000 r/min離心15 min，收集上層無(wú)色水相于1.5 ml Eppendorf管中，棄沉淀管。加入0.5 ml異丙醇，振蕩混勻，室溫孵育5 min。4℃，13 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入1 ml 75%乙醇并震蕩。4℃，13 000 r/min離心10 min，棄上清液。真空干燥離心機(jī)干燥5 min。加入8 μl DEPC處理水溶解RNA。取2 μl電泳分析RNA質(zhì)量。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 各組提取的總RNA重懸于6 μl DEPC水中，加入8 U RNasin，Oligod T15(500 ng/μl)，ICAM��1下游引物50 pmol，混勻，13 000 r/min離心30 s，70℃水浴5 min，然后立即置冰上冰浴(退火)。20 μl RT反應(yīng)體系中含5×RT緩沖液4 μl，12 U RNasin，4μl 2.5 mmol/L dNTPs，5 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，然后用DEPC處理水補(bǔ)足終體積至25 μl，輕敲混勻，稍離心，42℃水浴1.5 h后，于-20℃保存。

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增β�瞐ctin、ICAM��1基因。ICAM��1，β�瞐ctin PCR反應(yīng)條件：取RT反應(yīng)產(chǎn)物2 μl為模板，加入10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，ICAM��1上游引物0.5 μl(10 pmol/μl)，β�瞐ctin上、下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，補(bǔ)充消毒雙蒸餾水9 μl，再加入5 U/μl TaqE 1 μl，加入約25 μl左右的礦物油蓋于液面上。擴(kuò)增參數(shù)為94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，循環(huán)30次，然后72℃延伸10 min，停止，4℃保存。ICAM��1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為490 bp，β�瞐ctin擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為260 bp。

1.3.4 cDNA�睵CR產(chǎn)物電泳和照相分析 取PCR產(chǎn)物5 μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以Generuler 100 bp DNA Ladder Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，英國(guó)GENEGENIUS快速成像系統(tǒng)攝影，圖片經(jīng)英國(guó)GENEGENIUS圖像分析處理系統(tǒng)分析，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描，記錄光密度值，以ICAM��1/β�瞐ctin的比值作為ICAM��1 mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

1.4 克隆測(cè)序 回收ICAM��1擴(kuò)增產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物)，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收擴(kuò)增目的片段;按產(chǎn)品說(shuō)明書要求進(jìn)行PCR產(chǎn)物與T載體連接反應(yīng)，CaCl2法制備大腸桿菌DH5α新鮮感受態(tài)細(xì)胞100 μl，然后加入連接反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于氨芐青霉素陽(yáng)性(100 μg/ml)LB固體培基平板上，37℃倒置平板過(guò)夜培養(yǎng);第二天挑取培養(yǎng)板上數(shù)個(gè)單克隆菌落，接種至氨芐青霉素陽(yáng)性(100 μg/ml)LB液體培基(10 ml)，37℃，220 r/min，空氣搖床上振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液1 μl為模板在50 μl體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，隨機(jī)挑選獲陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果者送樣至上海博亞生物技術(shù)公司進(jìn)行序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT�睵CR結(jié)果 TNF�拨链碳�16HBE16 h后，與空白對(duì)照組比較，ICAM��1 RT�睵CR產(chǎn)物表達(dá)明顯增高;先予不同濃度的EM作用于16HBE 24 h或48 h后，再用TNF�拨链碳�16 h，與僅用TNF�拨链碳そM比較，各組16HBE ICAM��1 RT�睵CR產(chǎn)物表達(dá)均降低，且提示有濃度和時(shí)間依賴性。見圖1，表1。

1.Marker;2.對(duì)照組;3.TNF�拨�(20 ng/ml��16 h)刺激組;4.EM(0.3 μg/ml��24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);5.EM(3 μg/ml��24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);6.EM(30 μg/ml��24 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);7.EM(0.3 μg/ml��48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);8.EM(3 μg/ml��48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h);9.EM(30 μg/ml��48 h)+TNF�拨�(20 ng/ml��16 h)

2.2 RT�睵CR和克隆測(cè)序結(jié)果 ICAM��1 RT�睵CR產(chǎn)物分子大小約為700 bp，與原設(shè)計(jì)產(chǎn)物分子大小490 bp不相符，進(jìn)一步作克隆測(cè)序了解基因之間是否具有同源性。將ICAM��1 PCR產(chǎn)物DNA序列與ICAM��1基因進(jìn)行blast比較，具有高度同源性，顯示PCR產(chǎn)物即為目的基因：ICAM��1基因。見圖2�！”�1 EM對(duì)ICAM��1 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

細(xì)胞間黏附分子1(ICAM��1)是細(xì)胞表面黏附分子，屬免疫球蛋白超家族，能與白細(xì)胞功能相關(guān)抗原��1(LFA��1)即(CD11a/CD18)結(jié)合發(fā)揮作用。主要分布在各種上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，ICAM��1的生物學(xué)功能包括細(xì)胞黏附，細(xì)胞分化發(fā)育，參與抗原呈遞和T細(xì)胞活化，細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，炎癥等多方面。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取16HBE細(xì)胞ICAM��1mRNA進(jìn)行RT�睵CR，RT�睵CR產(chǎn)物DNA序列與ICAM��1基因具有高度同源性，顯示PCR產(chǎn)物即為目的基因：ICAM��1基因。但兩者之間存在差異，本實(shí)驗(yàn)提示，不同種族、不同組織細(xì)胞ICAM��1基因表達(dá)可能具有一定差異性。

上一頁(yè)  [1] [2] [3] [4] 下一頁(yè)