| 公開(公告)號 | CN100336912C |
| 公開(公告)日 | 2007.09.12 |
| 申請(專利)號 | CN200510012425.5 |
| 申請日期 | 2005.03.25 |
| 專利名稱 | 利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽-rhANP的方法 |
| 主分類號 | C12P21/02(2006.01)I |
| 分類號 | C12P21/02(2006.01)I;C12R1/19(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 深圳國家生化工程技術(shù)開發(fā)中心 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 林 楓;于志江;王玉樹;周兆平;章 剛;陳 旭;梁四五;姚小建;駱曉棟;歐陽藩 |
| 地址 | 518057廣東省深圳市深南大道市高新技術(shù)工業(yè)村W2-A2 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 深圳市智科友專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 曲家彬 |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽-rhANP的方法，其特征在于該方法包括如下工藝步驟：A、將斜面菌種經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)制成種子液；所述的將斜面菌種經(jīng)二級擴(kuò)大培養(yǎng)制備成種子液，其中第一級擴(kuò)大培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：胰蛋白胨6-15g/L，酵母粉3-8g/L，氯化鈉4-6g/L，氨芐青霉素50-200mg/L；接種量1-2％，培養(yǎng)溫度為28-32℃，培養(yǎng)周期為6-10小時；第二級擴(kuò)大培養(yǎng)中培養(yǎng)基選用甘油培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由下列成份組成：胰蛋白胨12-18g/L，酵母粉8-15g/L，氯化鈉5g/L，甘油5-10g/L；接種量1-2％，培養(yǎng)溫度28-32℃，培養(yǎng)周期12-18小時；B、將A步驟中制備的種子液按種子液：發(fā)酵培養(yǎng)基按2-5％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列體積重量份的組分：甘油3-8g/L，胰蛋白胨4-10g/L，酵母粉2-6g/L，KH2PO44-10g/L，K2HPO46-12g/L，(NH4)2SO41-4g/L，MgCl20.5-2g/L，微量元素1ml/L；培養(yǎng)溫度為28-32℃，培養(yǎng)15-20小時后誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為41-43℃，誘導(dǎo)時間4-6小時；升溫誘導(dǎo)之前，將菌體的平均比生長速率控制在0.2～0.4；所述的微量元素由下列成份組成：FeSO4·7H2O1-3g/L，CoCl2·6H2O2-4g/L，MnCl2·4H2O1-3g/L，CuSO43-8g/L，ZnSO41-4g/L，EDTA2-5g/L，H3BO33-6g/L，Na2MoO4·2H2O1.5-5g/L；發(fā)酵過程中細(xì)菌增殖階段的pH值控制在6.9-7.1，在目的基因表達(dá)階段的pH值為7.1-7.3，通氣量為0.5～1.5VVM，發(fā)酵過程的溶解氧濃度為15％-50％，并進(jìn)行補(bǔ)料，控制補(bǔ)料速率與菌體的消耗速率相當(dāng)，使發(fā)酵液中的甘油濃度維持在1.0～3.0g/L；發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體，離心條件為3500-5000rpm，4-10℃，15-20分鐘，發(fā)酵周期為19-26小時；所述的補(bǔ)料方式為對數(shù)流加方式，補(bǔ)料培養(yǎng)基由下列成份組成：甘油100-500g/L，酵母粉20-60g/L，胰蛋白胨20-50g/L，(NH4)2SO410-50g/L，MgSO48-20g/L；C、純化(1)包涵體的提�。簩步驟中收集的菌體按1∶5-10的比例用緩沖液重懸，緩沖液組成為150-250mMNaCl，10-50mMTris-HCl，1mMEDTA-Na2，PH7.5-9.0，冰水浴，用均質(zhì)機(jī)以600-700bar壓力勻漿，離心，收集包涵體沉淀；用緩沖液洗滌包涵體1-2次，該緩沖液組成為2M尿素，150-250mMNaCl，10-50mMTris-HCl，1mMEDTA-Na2，PH7.5-9.0，使其SDS-PAGE純度達(dá)到60％以上；將包涵體按1∶20-40的比例加入裂解液，室溫?cái)嚢?-8小時，離心，離心條件為8000-11000rpm，4-25℃，15-30分鐘，棄沉淀，取上清；所述的裂解液為8M尿素，50mMTris，PH8.3；(2)融合蛋白提�。河肧epharose6FF疏水層析提取融合蛋白，將(1)步驟中的上清液直接上樣或用2.2M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0稀釋一倍后上樣，以2M尿素，0.4M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0洗脫，280nm紫外檢測，收集目標(biāo)峰中的第一峰；(3)rhANP初步純化：將步驟(2)中的疏水層析收集物用緩沖液稀釋，該緩沖液組成為10-50mMTris-HCl，150-250mMNaCl，PH8.0-9.0，按每毫克融合蛋白用1-5單位凝血酶的用量加入凝血酶，于28-35℃反應(yīng)4-10小時；以0.1M乙酸-乙酸胺，150-250mMNaCl，0-25％乙腈為流動相，用Superdex30pg分離，收集目標(biāo)峰；(4)rhANP精細(xì)純化：采用高效液相色譜柱，流動相A為6％乙腈，0.05％-0.1％TFA，流動相B為30％乙腈，0.05％-0.1％TFA，進(jìn)行洗脫；收集目標(biāo)峰，去除乙腈和TFA，即為純化的rhANP；發(fā)酵菌種選用大腸桿菌遺傳工程菌株——pCW112-ANP/DH5α。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽-rhANP的方法。本發(fā)明利用大腸桿菌遺傳工程菌株——pCW112-ANP/DH5α經(jīng)過斜面菌種、擴(kuò)大培養(yǎng)制備種子液、高密度發(fā)酵、分離純化等工藝步驟制備純化的重組人心鈉肽-rhANP。本發(fā)明解決了ANP的表達(dá)和純化比較困難，因而限制了ANP的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的問題，具有成本低、原料與菌種易得、操作簡單，且生產(chǎn)條件易于控制、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，所制備的產(chǎn)物可有效的適于制藥領(lǐng)域的應(yīng)用。 |
| 國際公布 |
