| 公開(公告)號 | CN1314804C |
| 公開(公告)日 | 2007.05.09 |
| 申請(專利)號 | CN200510026025.X |
| 申請日期 | 2005.05.20 |
| 專利名稱 | 內(nèi)源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N5/04(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/74(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I;A61K36/481(2006.01)I;A61P9/10(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 上海中醫(yī)藥大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 杜 旻;胡之璧;劉 滌;周吉燕;王子艷;倪躍元 |
| 地址 | 201203上海市浦東新區(qū)蔡倫路1200號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權項 | 一種內(nèi)源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的方法，其特征在于：包括下列步驟：1)總核糖核酸提�。悍磻噭┑呐渲疲鹤冃砸�26mM檸檬酸鈉pH 4.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.125M 2-巰基乙醇，4M異硫氰酸胍；NaAc2M，pH 4.7；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1；70％乙醇；所有的試劑皆用0.1％焦碳酸二乙酯水處理過的無核糖核酸酶水配制，玻璃容器皆去核糖核酸酶；操作程序：取適量新鮮植物組織置于陶瓷研缽中，加入液氮快速研磨至細粉末，轉移至含有650μl變性液的1.5ml離心管中混勻；加入65μl 2M NaAc pH 4.0，反復顛倒混勻；再加入650μl酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1，混勻，冰浴15min；4℃，12000rpm，離心20min；上清轉移至一新的1.5ml離心管中，加等體積異丙醇，混勻后-20℃置30min；4℃，12000rpm，離心10min沉淀核糖核酸；棄上清液，將核糖核酸溶于0.5ml變性液中，65℃加熱盡快溶解；加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重復前步驟；離心后，棄上清液，加75％預冷乙醇1ml，漂洗沉淀，離心同上，棄上清；空氣干燥后，加20μl無菌雙蒸去離子水溶解核糖核酸，分光光度法和凝膠電泳檢測濃度和純度，余下部分-20℃保存?zhèn)溆茫?)逆轉錄互補脫氧核糖核酸寡聚脫氧胸苷酸37.5μM 2μl，總核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水10.5μl，70℃反應10min，立即置冰上，5×逆轉錄緩沖液4μl，核糖核酸酶抑制劑40U/μl 0.5μl，10mM脫氧核酸核苷三磷酸1μl，逆轉錄酶200U/μl 1μl，42℃反應1.5h，70℃反應10min滅活逆轉錄酶；3)引物設計根據(jù)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因的互補脫氧核糖核酸序列設計引物P2：5’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI：5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’P20：5’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P21：5’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’構建雙基因載體時擴增引物為：Psf：5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr：5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)聚合酶鏈式反應擴增互補脫氧核糖核酸1μl，引物15μM 2μl，引物25μM 2μl，10×緩沖液2μl，MgCl2 25mM1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30個循環(huán)→72℃延伸7min；5)連接pGEM-T載體：T4脫氧核酸緩沖液10×1μl，pGEM easy載體50ng/μl 1μl，聚合酶鏈式反應純化產(chǎn)物適量，T4脫氧核酸連接酶3U/μl 1μl，無菌雙蒸去離子水，將反應液混勻后4℃放置；6)感受態(tài)細菌的制備：從-70℃低溫冰箱取出菌種DH5α，接種于LB平板，37℃培養(yǎng)過夜進行活化，從活化平皿上挑取單菌落，接入5ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜250rpm，次日按1％V/V比例轉入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至OD600＝0.3～0.6也可，在無菌條件下，將50～100ml培養(yǎng)液轉入兩個預冷的無菌離心管中，冰上靜置10min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，倒置流盡培養(yǎng)液，加10ml預冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細菌，冰浴30min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，加2ml預冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細菌，即為感受態(tài)細胞；7)轉化與克隆篩選在制得的感受態(tài)細胞中加4μl載體連接質(zhì)粒脫氧核酸，冰浴30min后，于42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加入SOC培養(yǎng)基800μl，于37℃，180rpm搖床培養(yǎng)1hr；取培養(yǎng)物100μl鋪LB平板加相應的篩選抗生素，再加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，根據(jù)藍白斑篩選陽性克��；8)分別以引物對腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物Pxbai-P2擴增腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因模板1μl，引物15μM 2μl，引物5μM 2μl，10×緩沖液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3個循環(huán)→94℃變性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27個循環(huán)→72℃延伸7min，測序；9)雙酶切：10×雙酶切緩沖液10μl，限制性核酸內(nèi)切酶XbaI 10U/μl 3μl，限制性核酸內(nèi)切酶SacI 10U/μl 3μl，脫氧核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水37℃水浴1hr，取出75℃滅活內(nèi)切酶，取5μl電泳鑒定，其余部分酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1純化后，加1/10體積的3M NaAc，2體積的乙醇沉淀脫氧核糖核酸，靜置10min后，12000rpm，4℃，離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌兩次后晾干約10min，加適量的無菌水溶解，進行與載體的連接或者-20℃保存待用；10)質(zhì)粒pBI121的提取、雙酶切反應試劑的配制：LB液體培養(yǎng)基；溶液150mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH 8.0；溶液20.2M NaOH，1％十二烷基硫酸鈉；溶液35M KAc 60ml，HAc 11.5ml，無菌雙蒸去離子水28.5ml；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種內(nèi)源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的方法。本發(fā)明將多糖代謝途徑的兩個代謝反應偶連的關鍵酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因)，經(jīng)體外修飾，增加強化表達的調(diào)控元件，構建成功中間載體，通過電穿孔法將表達中間載體pBI-UG轉入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA-9402，獲得轉多糖合成雙基因的黃芪毛狀根。其中黃芪甲苷的含量比未轉基因的黃芪毛狀根高6倍。 |
| 國際公布 |
