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三 提取和純化
提取是將經(jīng)過(guò)處理或破碎的細(xì)胞，置于一定的條件和溶液中，讓被提取的生物大分子充分釋放出來(lái)的過(guò)程。影響提取的因素主要是被提取物質(zhì)在提取的溶液中溶解度的大小及由固相擴(kuò)散到液相的難易程度。某一物質(zhì)在溶劑中溶解度大小與該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及溶劑理化性質(zhì)有關(guān)，一般遵守“相似相溶”的原則。擴(kuò)散作用對(duì)生物大分子的提取有一定的影響。減小溶劑的粘度、攪拌和延長(zhǎng)提取時(shí)間可提高其擴(kuò)散速度，增加提取效果，提取的原則是“少量多次”，即對(duì)于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。
（一)蛋白質(zhì)（包括酶)的提取
大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因此，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。
1、水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1～5倍，提取時(shí)需要均勻地?cái)嚢�，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度一般采用低溫（５℃以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提取過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸、碘乙酸等)。
下面著重討論提取液的pH和鹽濃度的選擇：
（１)pH 蛋白質(zhì)和酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液提取。
（２)鹽濃度 稀鹽溶液可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用醫(yī)學(xué).全在.,線提,供bhskgw.cn。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCL等中性鹽，一般以0.15mol/L濃度為宜。緩沖液常采用0.02～0.05mol/L磷酸鹽或碳酸鹽的等滲鹽溶液。
2、有機(jī)溶劑提取法
一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，可用乙醇、丙酮或丁醇等有機(jī)溶劑提取。它們具有一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性，是理想的提取脂蛋白的提取液，但必須在低溫下操作。
丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。
（二)蛋白質(zhì)的分離純化
蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有以下幾類。
1、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法
(１)蛋白質(zhì)的鹽析 中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，稱為鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子如硫酸銨有很強(qiáng)的水化作用，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液ｐＨ在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。
蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的是硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溶解度的溫度系數(shù)小而溶解度大（25℃時(shí)飽和溶液為4.1mol/L，即541.2ｇ/Ｌ；０℃時(shí)溶解度為3.9mol/L(514.8ｇ/Ｌ)，在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的ｐＨ常在4.5～5.5之間，當(dāng)用其他ｐＨ進(jìn)行鹽析時(shí)，需要硫酸或氨水調(diào)節(jié)。
蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙)，用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷地更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡聚糖凝膠Ｇ—２５或Ｇ－５０過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間比較短。
(２)等電點(diǎn)沉淀法 蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的ｐＨ達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合使用。
(３)低溫有機(jī)溶劑沉淀法 用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出。此法分離效率比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法
（１)透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分子分開(kāi)。超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。
（２)凝膠過(guò)濾法 也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠（詳見(jiàn)層析技術(shù))。
3、根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離
蛋白質(zhì)在不同ｐＨ環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開(kāi)。
（１)電泳法 各種蛋白質(zhì)在同一ｐＨ條件下，因相對(duì)分子質(zhì)量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)（詳見(jiàn)電泳技術(shù))。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的ｐＨ梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的ｐＨ位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。
（２)離子交換層析法 離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素)和陰離子交換劑（二乙基氨基乙基纖維素)，當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變ｐＨ或離子強(qiáng)度的辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)（詳見(jiàn)層析技術(shù))。
4、根據(jù)配體特異性的分離方法———親和層析法
親和層析法是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它通常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。例如，酶－輔酶，抗原－抗體，激素－受體等。（親和層析的基本原理詳見(jiàn)層析技術(shù))
蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離、提純和鑒定是生物化學(xué)中的重要部分，至今還沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
（三)核酸的提取
核酸都溶于水，而不溶于有機(jī)溶劑，利用此性質(zhì)進(jìn)行提取。在細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白（DNP)，RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白（RNP)，在不同濃度的鹽溶液中它們的溶解度差別很大，DNP在純水或1 mol/LNaCl溶液中溶解度較大，但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低，相反，RNP易溶解。因此，用0.14mol/LNaCl溶液可簡(jiǎn)單地初步分開(kāi)DNP和RNP。
在分離核酸中最困難的是將核酸與緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，而且還要避免核酸的降解。常用的解離劑是陰離子去垢劑，如脫氧膽酸鈉，十二烷基硫酸鈉（SDS)，４－氨基水楊酸鈉和萘－1，5－二磺酸鈉等，它們具有溶解病毒、細(xì)菌的作用，可使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來(lái)，還具有抑制核糖核酸酶的作用。另外除去核酸中的蛋白質(zhì)的一個(gè)有效辦法是用酚－氯仿混合液，它們可使蛋白質(zhì)變性，并對(duì)核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有機(jī)相和水相完全分開(kāi)，減少殘留在水相中的酚。在用酚－氯仿抽提核酸提取液時(shí)，還須要?jiǎng)×艺駬u，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，在酚－氯仿抽提液中再加上一定量的異戊醇。
（四)核酸的純化
核酸的純化最關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，通常只要用酚／氯仿、氯仿抽提核酸的水溶液即可。每當(dāng)需要把DNA克隆操作的某一步所用的酶滅活或去除以便進(jìn)行下一步時(shí)，可進(jìn)行這種抽提。然而，如果從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶Ｋ等，它們對(duì)多數(shù)天然蛋白質(zhì)均有活性。
用酚／氯仿抽提：這兩種有機(jī)溶劑合用，比單獨(dú)用酚抽提除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。具體步驟如下：
①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚／氯仿；②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀；③12000ｇ室溫離心15ｓ；④水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機(jī)相；⑤重復(fù)步驟①～④，直至兩相界面上無(wú)蛋白質(zhì)為止；⑥加入等體積的氯仿并重復(fù)②～④步操作；⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。
(五)核酸的濃縮
應(yīng)用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價(jià)陽(yáng)離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成的核酸沉淀可經(jīng)離心而回收。甚至對(duì)低至ｐｇ（皮克)量的DNA或RNA，也可定量回收�；厥盏暮怂峥砂此铦舛�，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。具體操作時(shí)，可向含樣品的小離心管中加入單價(jià)陽(yáng)離子鹽貯存液。單價(jià)陽(yáng)離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時(shí)應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時(shí)，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時(shí)該去垢劑在70％乙醇中仍保持可溶。
DNA和RNA的沉淀，大多使用醋酸鈉（pＨ5.2)。
