網(wǎng)站首頁(yè)
醫(yī)師
藥師
護(hù)士
衛(wèi)生資格
高級(jí)職稱(chēng)
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學(xué)考研
醫(yī)學(xué)論文
醫(yī)學(xué)會(huì)議
考試寶典
網(wǎng)校
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線(xiàn) > 執(zhí)業(yè)獸醫(yī) > 養(yǎng)牛 > 疾病防治 > 正文:奶牛新孢子蟲(chóng)病
    

牛病誤區(qū)防治:奶牛新孢子蟲(chóng)病

奶牛新孢子蟲(chóng)病

     

新孢子蟲(chóng)病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲(chóng) ( Neospora caninum Dubey,1988)寄生于犬、牛、羊等多種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲(chóng)病。該病1984 年由挪威獸醫(yī)學(xué)家Jcerkas在患腦炎和肌炎的幼犬 體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn),1988年Dubey博士將其命名為犬新孢子蟲(chóng)[1]。犬新孢了蟲(chóng)的終末宿主是犬[2],牛、羊、犬、馬、鹿、小鼠等均可作為中間宿主。雖然新孢子蟲(chóng)病是多種家畜共患的一種原蟲(chóng)病,但其對(duì)牛的危害尤為嚴(yán)重,主要造成母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及新生兒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病,同時(shí)該病可垂直傳播,帶蟲(chóng)母牛可將蟲(chóng)體直接傳給新生犢牛,已證實(shí)它是造成奶牛工業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的一個(gè)重要原因。由于我國(guó)每年從歐美及周邊國(guó)家引進(jìn)大量種牛或商品牛,很可能將本病帶入我國(guó)。本病防制的關(guān)鍵在于診斷,為此作者就近年國(guó)外學(xué)者奶牛新孢子蟲(chóng)病診斷方法進(jìn)行了綜述,供同行們參考。以下介紹的是奶牛疾病防治:

1 臨床診斷

生前診斷主要依靠臨床癥狀觀察。本病一年四季均可發(fā)生,但高峰多出現(xiàn)在夏季,感染在母畜間不存在年齡差異,以妊娠6個(gè)月以前流產(chǎn)的胎兒血清 陽(yáng)性比例較高,引起的流產(chǎn)常呈散發(fā)性或地方性流行,因此當(dāng)出現(xiàn)母畜流產(chǎn),死產(chǎn),新生兒癱瘓、畸形,共濟(jì)失調(diào),肌肉萎縮,抽搐或其它運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病 癥狀時(shí),特別是一群或多群出現(xiàn)此類(lèi)癥狀時(shí)應(yīng)懷疑是否為新孢子蟲(chóng)感染[3,4] 。

2 病原學(xué)診斷

2.1 病理組織學(xué)檢查

根據(jù) N.caninum 的寄生部位,在新生兒的肌肉、腦組織、呼吸道分泌物及皮膚膿包等活組織中均能檢查到 N.caninum 。應(yīng)采集流產(chǎn)胎兒的腦、脊髓、心臟及肝等組織進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查。可見(jiàn)多灶性、非化膿性腦炎、神經(jīng)炎、心肌炎、骨骼肌炎、肝炎以及細(xì)胞浸潤(rùn)等,但要確診,必須檢測(cè)到 N.caninum 速殖子和(或)組織包囊[5] 。

2.2 病原的分離培養(yǎng)

為了分離及培養(yǎng) N.cani-num 病原,可采集待檢動(dòng)物病料組織,勻漿后皮下接種小鼠、大鼠、小沙鼠、犬、、家等。接種劑量依 據(jù)動(dòng)物種類(lèi)不同而不同。發(fā)病后采集中樞神經(jīng)或內(nèi)臟組織進(jìn)行特異性檢驗(yàn),也可進(jìn)行傳代接種。 N. caninum 的體外培養(yǎng)已獲成功,可在牛腎細(xì)胞、Vero細(xì)胞等傳代細(xì)胞系中生長(zhǎng)發(fā)育,常用牛單核細(xì)胞和牛心肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。Davison等[6] (1997)將約10 g新鮮的死胎犢牛腦組織用0.5%的胰蛋白酶勻漿消化后接種到6份Vero細(xì)胞上。在 含有5%CO2、95%空氣混合物的RPMI-1640培養(yǎng)液中,于37°C 下維持培養(yǎng)。接種后29天在一份培養(yǎng) 液中首次觀察到典型的 N.caninum 速殖子。Ya- mane等[7](1997)采集16頭流產(chǎn)胎兒和疑似新孢子 蟲(chóng)病犢牛組織樣本,接種于牛心肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和猴腎細(xì)胞培養(yǎng)物中,接種后49天在一份細(xì)胞中觀 察到 N.caninum 速殖子。這表明病原的分離和體外培養(yǎng)可用于新孢子蟲(chóng)病的特異性診斷。

2.3 免疫組織化學(xué)檢查蟲(chóng)體

采集病死動(dòng)物的大腦、脊髓,或肝、腎、胎盤(pán),或其它病變部位,切片后用免疫組織化學(xué)染色。犬 N.caninum 血清可使蟲(chóng)體特 異性著染,而弓形蟲(chóng)和其它原蟲(chóng)血清則不能,可進(jìn)行特異性診斷 [1,8]。抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶染色法(ABPC法)就是其中的一種,Lindsay用兔抗 N.caninum 血清對(duì)組織切片進(jìn)行染色,可檢測(cè) 到新孢子蟲(chóng)速殖子和緩殖子。而對(duì)龔地弓形蟲(chóng)、哈 氏哈芒球蟲(chóng)、枯氏肉孢子蟲(chóng)、杰利氏貝諾孢子蟲(chóng)等不著染,同時(shí)兔抗龔地弓形蟲(chóng)血清對(duì) N.caninum 無(wú)反應(yīng) [1] 。

3 血清學(xué)診斷

有效的血清學(xué)檢測(cè)對(duì)于牛流產(chǎn)的準(zhǔn)確診斷、新孢子蟲(chóng)病傳播的流行病學(xué)調(diào)查以及 N.caninum 其它中間和終末宿主的確定是十分必要的。目前,檢測(cè)牛 N.caninum 抗體的許多種血清學(xué)方法已得到報(bào)道,包括間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)、Western blot試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)以及ELISA檢測(cè)方法等。其中IFAT 和ELISA方法應(yīng)用廣泛,且檢測(cè)結(jié)果的特異性和敏 感性都較高[9,10]。

3.1 間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)

將Vero細(xì)胞傳代細(xì)胞系培養(yǎng)的 N.caninum 固定在載玻片上,用IF-AT測(cè)定血清和初乳中抗 N.caninum IgG的抗體效價(jià),血清中IFAT抗體效價(jià)為1200~11600,甚至高達(dá)16400。另外,也可檢查患畜腦脊髓液中的抗體,本法尤其適用于犢牛先天性 N.caninum 感染。本法特異性較強(qiáng),敏感性較高,檢測(cè)動(dòng)物血清抗體時(shí)血清稀釋100倍后不與龔地弓形蟲(chóng)發(fā)生交叉反應(yīng)[2,9,11] 。Okeoma,Williamson對(duì)269份自然感染N.caninum的牛血清樣本進(jìn)行了不同抗體滴度的IFAT檢測(cè),結(jié)果表明盡管抗體滴度存在著波動(dòng),但I(xiàn)FAT滴度相同的組中 N.caninum 速殖子抗原的染色體條帶形式仍然相同,此法可用于識(shí)別 N.cani- num 速殖子抗原[12]。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

現(xiàn)有研究中ELISA檢測(cè)法主要建立在整體或部分純化的自然性N.aninum 抗原或重組的 N.canmum 抗原,或 N.can- inum 抗體活性以及 N.caninum特異性競(jìng)爭(zhēng)抑制性單克隆抗體(MAbs)的基礎(chǔ)之上。目前,已研制出了有效的ELISA診斷試劑盒。其中建立在 N.caninum 單克隆抗體(MAb)和表面抗原基礎(chǔ)上的ELISA檢 測(cè)方法的應(yīng)用廣泛,而且診斷的特異性和敏感性都 較高[9,10,13]。

3.2.1 ELISA目前,已研制出了有效的 N.caninum

ELISA診斷試劑盒。Williams[14]等學(xué)者對(duì)ELISA試劑盒檢測(cè)牛血清 N.cqninum 抗體的效果進(jìn)行了估測(cè),并與IFAT的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。依試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果小于20pp的樣本為陰性,在20~25pp范圍內(nèi)為可疑,大于25pp的為陽(yáng)性樣本[pp為檢測(cè)樣本的OD值與陽(yáng)性對(duì)照血清(IFAT 效價(jià)為15120)平均OD值的百分比]。結(jié)果表明,該法與IFAT檢測(cè)結(jié)果有較高一致性,并且更為可 靠,特異,敏感。另外,也可應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)牛乳中 N.caninum 抗體,Schares G,Barwald A等人應(yīng)用ELISA檢測(cè)牛乳中新孢子蟲(chóng)抗體,指出稀釋比12的牛乳可得到與相應(yīng)血清檢測(cè)呈線(xiàn)性相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15]。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,Biovet ELISA試劑盒和IDEXX ELISA試劑盒的特異性和敏感性都大于95%,可作為檢測(cè)牛 N.caninum 抗體的有效方法[14] 。

3.2.2 MAb-cELISA Baszler等[16]

(1999)人在原有研究基礎(chǔ)上,對(duì)以單克隆抗體(MAb 4A4-2)為基礎(chǔ)的競(jìng)爭(zhēng)抑制性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)進(jìn)行了改良。改良后的cELISA方法應(yīng)用特異性單克隆抗體(5B6-25存在于弗氏完全佐劑中)來(lái)俘獲自然性N.caninum 抗原,并使之與競(jìng)爭(zhēng)性單克隆抗體(MAb 4A4-2)直接結(jié)合,這兩種單克隆抗體可 以結(jié)合在不同的抗原表位上而得到保存,它們都主導(dǎo)免疫65-Kda N.caninum 速殖子表面抗原(Nc- 1分離株)。cELISA 方法可以減少非特異性抗體結(jié)合,而且允許應(yīng)用未稀釋的待檢血清以提高診斷的特異性和敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中診斷敏感性為97.6%,診斷特異性為98.6% ,表明該法對(duì) N.caninum陽(yáng)性與陰性樣本具有敏銳的識(shí)別力。 N.caninum cELISA的特異性取決于MAb 4A4-2,且它可以與抗原直接結(jié)合,因此對(duì)cELISA的改良以及類(lèi)似于凝集實(shí)驗(yàn)等其它輔助性檢驗(yàn)是沒(méi)有必要的。 cELISA是一種檢測(cè)牛 N.caninum 抗體的快速,靈敏,準(zhǔn)確的方法 [9,13,17]。

3.2.3 以 N.caninum 表面抗原為基礎(chǔ)的ELISA

N.caninum 表面存在許多抗原,N.caninum 主要表面 抗原可作為新孢子蟲(chóng)病的一個(gè)重要診斷劑。 NcSAG1是 N.caninum 一個(gè)主要表面抗原,Cha-han 等人將編碼缺少信號(hào)肽和C末端疏水功能區(qū)的 NcSAG1(NcSAGlt)的基因克隆,并通過(guò)與谷光甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)一起作為融合蛋白而使之在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。將純化的GST-NcSAG1t應(yīng)用到ELISA中以檢測(cè)牛新孢子蟲(chóng)抗體。該法可對(duì)IFAT 檢測(cè)呈陽(yáng)性和陰性的牛血清進(jìn)行明顯的區(qū)分,而且它不會(huì)產(chǎn)生與實(shí)驗(yàn)性感染龔地弓形蟲(chóng)小鼠的交叉反 應(yīng)[18]。Howe和Tang [19](2002)對(duì) N.eaninum 主要表面抗原rNcp29進(jìn)行了研究,并設(shè)計(jì)了rNcp29r ELISA以檢測(cè)牛血清中特異性抗體,Ncp29由與龔地弓形蟲(chóng)特異性SAGl基因同源的基因來(lái)編碼,是 一種重組的表面蛋白,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該法可以很快區(qū)分 N.caninum 血清反應(yīng)陽(yáng)性的牛群([OD]大于1.2,稀釋度為1500或更高)和陰性對(duì)照組([OD]小于0.5,稀釋度為1500)。另外,從龔地弓形蟲(chóng)或 枯氏肉孢子蟲(chóng)的動(dòng)物體分離的血清ELISA檢測(cè)結(jié) 果為陰性,因此rNcp29r ELIhttp://bhskgw.cn/shouyi/ya/jiage/SA對(duì)于檢測(cè) N.caninum抗體具有高度的特異性和敏感性。Hye-Jin AHN和Sera KIM等(2003)對(duì)另一個(gè) N.caninum 表面抗原Ncp43 ( N.caninum Korean株)進(jìn)行了研究,其抗原表位位于該分子C末端的23 處(Son et al.,2001),將純化的GST與Ncp43 C末端的23處(P片段)進(jìn)行融合(可應(yīng)用一個(gè)相對(duì)較短的缺少特征性標(biāo)記的6xHis替代GST),并將其作為抗原設(shè)計(jì)ELISA試驗(yàn)。結(jié)果表明該法能夠準(zhǔn)確 的檢測(cè)出特異性 N.caninum 抗體,而且Ncp43與龔地弓形蟲(chóng)的TgSAGlA一起可用于不同哺乳動(dòng)物的 N.caninum 和龔地弓形蟲(chóng)感染的鑒別診斷 [20,21]。另外,其它幾種重組的 N.caninum 抗原如Nc4.1 和Nc14.1 也可作為重組蛋白進(jìn)行ELISA試驗(yàn) 以檢驗(yàn)特異性 N.caninum 抗體[19] 。

4 分子生物學(xué)診斷

目前,奶牛 N.caninum 病分子生物學(xué)診斷方法

中應(yīng)用較多的主要是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。此法多以 N.caninum 特異性表面抗原為基礎(chǔ),適用于感 染細(xì)胞培養(yǎng)基中的病原和福爾馬林固定、石蠟包埋 的組織中 N.caninum 病原的檢測(cè)。

4.1 Indirectly in situ PCR

此法是Loschen-ber- ger等(2004)研究的檢測(cè) N.caninum 的一種新方法,它具有高度的特異性和敏感性,能替代免疫組化方法,可通過(guò)半抗原標(biāo)記的核苷PRINS反應(yīng)檢測(cè)到,也可通過(guò)熒光染色體標(biāo)記的抗體顯示出來(lái)[22]。

4.2 檢測(cè)Nc-5基因的PCR

Paula等(2004)從12頭2歲的妊娠5個(gè)月流產(chǎn)牛胎的臨床樣本中采集血液并分離DNA,應(yīng)用Np21+和Np6+引物對(duì)對(duì)N.caninum NC-5基因的350bp片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)應(yīng)用Tim3和Tim11引物對(duì)對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄阻斷物1 (ITSI)進(jìn)行擴(kuò)增。證明此法效果很好[23]。Fernandez和Mora(2002)設(shè)計(jì)了一個(gè)二次PCR 法以定量檢測(cè)牛流產(chǎn)胎兒中的 N.caninum ,他們?cè)O(shè)計(jì)寡聚核苷酸引物以擴(kuò)增 N.caninum Nc-5序列的76bp DNA片段的相應(yīng)基因。結(jié)果表明這種PCR方法可用于新孢子蟲(chóng)病的定量檢測(cè)[24]。另外,Müller 和Vonlaufen(2002)設(shè)計(jì)了二次熒光PCR試驗(yàn)以定量檢測(cè)鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織切片中的新孢子蟲(chóng),這 種應(yīng)用雙重?zé)晒怆s交技術(shù)的PCR可有效的檢測(cè)腦組織中的新孢子蟲(chóng)[25] 。

4.3 單管套式PCR(single tube nested PCR)

El-lis,McMillan等[26](1999)描述了一種檢測(cè)新孢子蟲(chóng)的具有兩個(gè)連續(xù)步驟的單管套式PCR技術(shù)(single tube nested PCR)這種PCR診斷法對(duì)于靶序列的特異性復(fù)制產(chǎn)物特別敏感,可從分離于自然感染的牛及犬的福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中擴(kuò)增 N.caninum DNA,達(dá)到臨床診斷的目的。并對(duì)PCR MIMIC也做了描述,有待于更深入的研究以證實(shí)此 項(xiàng)技術(shù)對(duì)于研究 N.caninum 生物學(xué)特性中的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述,奶牛 N.caninum 病的診斷要結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)、病理組織學(xué)變化的特點(diǎn),應(yīng)用多 種檢測(cè)方法進(jìn)行綜合診斷。血清學(xué)檢測(cè)和PCR檢 測(cè)是診斷奶牛 N.caninum 病的有效方法。特異性PCR檢測(cè)以及建立在 N.caninum 特異性表面抗原和競(jìng)爭(zhēng)抑制性單克隆抗體基礎(chǔ)上的ELISA方法,診斷的特異性和敏感性都很高,適用于感染細(xì)胞培養(yǎng)基中的病原和福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中 N. caninum 病原的檢測(cè)。在實(shí)際工作中,我們要根據(jù)實(shí)際情況,選用相應(yīng)的方法診斷奶牛的新孢子蟲(chóng)病。


畜牧導(dǎo)航: 養(yǎng)牛資訊   養(yǎng)牛技術(shù)   牛價(jià)格行情   疾病防治   飼養(yǎng)管理   養(yǎng)牛問(wèn)答
醫(yī)學(xué)全在線(xiàn) 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
浙ICP備12017320號(hào)
百度大聯(lián)盟認(rèn)證綠色會(huì)員 實(shí)名網(wǎng)站 360認(rèn)證 可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗(yàn)證