一、Southern印跡法
Southern印跡法在鑒定LDL-R基因缺失突變中得到了廣泛的應(yīng)用。采用多種限制性內(nèi)切酶切，以LDL-R基因片段和外顯子特異性片段作探針，進(jìn)行雜交，再放射自顯影，對(duì)FH進(jìn)行限制性酶切圖譜分析，可檢測(cè)FH患者的不同外顯子區(qū)域不同長(zhǎng)度的部分缺失類型。
二、PCR法和核苷酸序列分析法
采用PCR法將包括點(diǎn)突變的受體基因片段擴(kuò)增，再經(jīng)核苷酸序列分析即可發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變位點(diǎn)。影響酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變可經(jīng)PCR擴(kuò)增、特定的限制性酶切、電泳，檢測(cè)出異常片段。
三、寡核苷酸探針?lè)?/strong>
本法采用的是一對(duì)寡核苷酸探針，其中一個(gè)與正常基因順序互補(bǔ)，另一個(gè)與突變序列互補(bǔ)，因此需用到多種特異的寡核苷酸探針，是鑒定點(diǎn)突變的一種快速而簡(jiǎn)便的方法，當(dāng)一個(gè)或二個(gè)點(diǎn)突變?cè)谀骋惶囟ㄈ巳褐谐蔀橥蛔兊闹饕驎r(shí)，就可建立這種方法對(duì)某一地區(qū)的某一主要突變進(jìn)行篩查。
四、RFLP連鎖分析法
限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)是采用不同的限制性核酸內(nèi)切酶酶切和多種cDNA片段探針，根據(jù)DNA多態(tài)性片段的出現(xiàn)，確定LDL-R基因的連鎖相。
本法需進(jìn)行家系分析，多態(tài)位點(diǎn)必須有一個(gè)以上是雜合的，并且要排除細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)基因重組對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的影響。
五、長(zhǎng)鏈PCR法
bhskgw.cn/shiti/常規(guī)的PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度不超過(guò)3kb，不適合檢測(cè)大片段的受體基因缺失突變，Southern印跡法亦繁瑣復(fù)雜，近年來(lái)長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)的研究為檢測(cè)LDL-R開(kāi)辟了新途徑。下面詳細(xì)介紹由周天鴻等建立的長(zhǎng)鏈PCR法在檢測(cè)LDL-R基因大片段缺失突型中的應(yīng)用。
引物：設(shè)計(jì)5對(duì)寡核苷酸引物，見(jiàn)表20-6。
表20-6 PCR擴(kuò)增引物序列
| PCR引物 | 核苷酸序列 |
| PA1 | 5’CAACACACTCTGTCCTGTTTTCCAG3’ |
| PA2 | 5’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’ |
| PB1 | 5’AGTCTGCATCCCTGGCCCTGCGCAG3’ |
| PB2 | 5’AGGGCTCAGTCCACCGGGGAATCAC3’ |
| PC1 | 5’CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCGAC3’ |
| PC2 | 5’CCACCCTCCGCCTTCCCGTGCTCAG3’ |
| PD1 | 5’bhskgw.cn/kuaiji/TCCATCGACGGGTCCCCTCTGACCC3’ |
| PD2 | 5’AGCCCTCATCTCACCTGCGGGCCAA3’ |
| PE1 | 5’AGATGAGGGCTCCTGGTGCGATGCC3’ |
| PE2 | 5’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’ |
DNA：由健康人和FH患者外周血制備DNA。
長(zhǎng)鏈DNA擴(kuò)增：采用引物PA1和PA2擴(kuò)增LDL-R基因中外顯子5～10的片段。
PCR擴(kuò)增制備探針：采用引物PB1/PB2、PC1/PC2、PD1/PD2、PE1/PE2制備LDL-R基因外顯子7、8、9、10的同位素探針。
PA1對(duì)應(yīng)于LDL-R基因外顯子5的5"端側(cè)翼序列，PA2對(duì)應(yīng)于外顯子10的部分序列，此對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物為含外顯5～10的基因片段。正常人得到1條7kbDNA片段，F(xiàn)H患者得到2條DNA片段，一條7kb，一條4.4kb，表明FH患者是雜合子，其一個(gè)LDL-R等位基因正常，另一個(gè)等位基因外顯子5～10之間存在著一個(gè)2.6kb的缺失，見(jiàn)圖20-4。將產(chǎn)物用EcoR1酶切，得到的產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖20-5。最后用PB、PC、PD、PE4對(duì)引物，以正�；虻拈L(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物為模板，用PCR法獲得外顯子7、8、9、10的探針，將這些探針?lè)謩e與正�；虻耐蛔兓虻拈L(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物雜交，其結(jié)果見(jiàn)表20-7。
采用長(zhǎng)鏈PCR技術(shù)可快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地檢測(cè)大片段的缺失突變，可應(yīng)用于臨床基因診斷，尤其是有遺傳背景的FH高危人群的基因篩查。
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圖20-4 FH患者LDL-R基因缺失示意圖
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圖20-5 長(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物電泳示意圖
a：FH患者基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b：健康人基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c：CNA分子量標(biāo)記。
表20-7 LDL-R突變基因和正�；蜷L(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物與外顯子7～10探針的雜交結(jié)果
| 長(zhǎng)鏈PCR產(chǎn)物 | 探針外顯子7 | 探針外顯子8 | 探針外顯子9 | 探針外顯子10 |
| 突變基因 | - | - | + | + |
| 正�；� | + | + | + | + |
（劉芳)
