動脈粥樣硬化:第二節(jié)　載脂蛋白E表型

ApoE是一種含有299個氨基酸的單鏈多肽糖蛋白（Mr34200)，主要存在于CM、VLDL和HDL中。 1975年Utermann等將脫脂的VLDL進行IEF電泳時，首先提示ApoE多態(tài)性的存在。ApoE多態(tài)性的產(chǎn)生是由于其一個遺傳位點上的3個主要等位基因ε2、ε3、ε4所編碼的3種主要ApoE異構(gòu)體E2、E3、E4之間單個氨基酸替換及其與四種受體的親和力不同。人群中有6種不同的ApoE表型：三種純合子（E2/2、E3/3、E4/4)和三種雜合子（E3/2、E4/2、E4/3)。ApoE3是人群中最常出現(xiàn)的形式，常被稱為“野生型”（Wild-type)，其多肽鏈112位和158位均為Arg。

ApoE多態(tài)性主要由其基因多態(tài)性所決定，另外也受到翻譯后化學(xué)修飾的影響。許多研究資料表明，ApoE多態(tài)性不僅CHD、AS的發(fā)生發(fā)展及危險性密切相關(guān)，而且與Alzheimer�。ˋD)發(fā)生有關(guān)聯(lián)，這些領(lǐng)域的研究已引起人們廣泛關(guān)注與濃厚興趣。許多臨床及研究實驗室對比進行了廣泛的研究，依據(jù)被檢查病人的類型，已建立了幾種快速準(zhǔn)確測定ApoE表型的方法。

一、ApoE表型檢測的方法學(xué)

ApoE表型檢測即可以以VLDL為樣品，又可以直接以血清（或血漿)為樣品，通過IEF電泳分析、雙向PAGE或結(jié)合免疫印跡法進行測定。

1．等電聚焦（IEF)：由于三種主要ApoE異構(gòu)體E2、E3和E4的等電點（pⅠ)分別為5.89、6.02和6.68，E4比E3多一個正電荷，而E2比E3少一個正電荷。因此，可應(yīng)用1EF檢測這些異構(gòu)體間電荷差異而確定不同ApoE表型。傳統(tǒng)ApoE表型檢測方法多采用超速離心法或化學(xué)沉淀法分離VLDL，脫脂后進行IEF，然后進行染色分析。這種方法需要血清量較多，昂貴、費時，又需要大型設(shè)備，不適合大規(guī)模研究。ApoE異構(gòu)體之間染色程度之間差異及電泳過程中泳動距離的變異性也造成結(jié)果的不穩(wěn)定性。

2．免疫印跡法（immunoblotting)：血清脫脂后，經(jīng)IEF電泳將ApoE與其他蛋白質(zhì)分離，然后將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC)膜上，用抗ApoE抗體作為一抗進行免疫印跡反應(yīng)或采用直接的免疫固定法，即可靈敏而特異地顯示出ApoE區(qū)帶的位置，從而確定ApoE表型。此方法利用抗原-抗體的特異反應(yīng)，排除了血清其他蛋白質(zhì)的干擾，不需超速離心分離VLDL，血清用量少，是國內(nèi)外實驗室檢測ApoE表型常用的方法之一。但此類方法亦存在一些缺點，如對于存在與普遍異構(gòu)體具有相同電荷的罕見異構(gòu)體標(biāo)本，或在糖尿病等病理狀態(tài)時，由于轉(zhuǎn)錄后修飾引起蛋白質(zhì)變化的標(biāo)本檢測時，就會給出錯誤的結(jié)果。

3．雙相電泳（two-dimensionalelectrophoresis)

第一相應(yīng)用IEF電泳將等電點不同的蛋白質(zhì)分離；第二相根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同及濃度的差異，應(yīng)用SDS-PAGE進行分離，由此確定ApoE表型。此技術(shù)能解決IEF遇到的一些轉(zhuǎn)錄后修飾的問題，臨床標(biāo)本用量也很少，并且可以同時進行定性和定量分析，但由于成本昂貴而且費時，有時也難以清晰地分辨表型，故臨床上應(yīng)用較少。

二、IEF電泳檢測ApoE表型

本法以VLDL為測定樣品。首先利用超速離心機自血清中分離VLDL，一方面可去除血清雜蛋白的干擾，另一方面也可達(dá)到富集ApoE的作用，因ApoE主要存在于VLDL。

1．儀器與試劑

電泳儀，垂直板式電泳槽，超速離心機，光密度計，大培養(yǎng)皿；主要試劑有：①1.00g/mlNaBr與1.20g/ml NaBr溶液；②脫脂液為乙醇/乙醚混合液（3：1,V/V)；③樣品溶解液為0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2,內(nèi)含1%SDS，5%β-巰基乙醇及13%蔗糖；④凝膠貯存液；丙烯酰胺（Acr)30g，NN’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis)1.2g，加水至100ml；⑤電極緩沖液：0.01mol/lH₃PO₄（陽極)，0.02mol/L NaCl（陰極)；⑥凝膠應(yīng)用液：PAG濃度為7.5%，內(nèi)含1.6%兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,pH4.0～6.5,Pharmacia)；⑦0.2%CBBG250染色液；⑧脫色液：甲醇/水/乙酸溶液（5：5：1，V/V)。

2，實驗方法

①人血清VLDL的分離；取血清3.0ml，加入固體NaBr使其密度增加至1.30g/ml。在BeckmanL8-80離心機T_i80轉(zhuǎn)頭離心管中依次加入密度為1.00g/ml,1.20g/ml的NaBr溶液和1.30g/ml的血清樣品，形成1.00～1.30g/ml的不連續(xù)密度梯度。10℃，70000r/min超速離心2h，離心后在管頂層可見白色乳狀液體，此即為VLDL，小心收集0.3～0.5ml并轉(zhuǎn)移至已準(zhǔn)備好的脫脂管內(nèi)脫脂。②VLDL的脫脂：按Scanu(1971)法進行。先用3：1（V/V)乙醇/乙醚混合液在-20℃脫脂兩次，每次9～12h，繼用乙醚脫脂1次，2h。每次脫脂后在-15℃離心收集沉淀，3000r/min,15min。末次離心后在管中加入0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2，內(nèi)含1%SDS，2%兩性電解質(zhì)載體，5%β-巰基乙醇及13%蔗糖的溶液60μl，并在室溫下孵育30min，最后用氮氣吹盡殘存的乙醚，此即為IEF電泳的樣品。③IEF電泳：按Menzel等（1983)法進行。垂直板PAG濃度為7.5%，內(nèi)含1.6%pH4.0～6.5的兩性電解質(zhì)載體。電泳凝膠用0.2%CBBG250染色。脫色后至圖像清晰后照像掃描。④ApoE表型判定：根據(jù)電泳圖譜，依據(jù)E2、E3、E4各區(qū)帶光密度比例確認(rèn)ApoE各表型，如圖19-3和表19-1所示。

圖19-3 VLDL的IEF-PAGE圖

表19-1ApoE表型的鑒定

由于ApoE即有主要異構(gòu)體，又有次要異構(gòu)體，有時使表型確定較為困難。一般情況下，應(yīng)用此法較易確定ApoE純合bhskgw.cn/pharm/子表型，但對于某些雜合子表型的判定要慎重，往往要在色帶經(jīng)過光密度掃描以后，根據(jù)兩條色帶顏色深淺之比才能最后定論。如仍難以確定時，可用唾液酸酶處理VLDL，使次要異構(gòu)體減少或消失，而有利于表型的判定。

三、免疫印跡法檢測ApoE表型

由于IEF法需大型設(shè)備，工作量較大，極大地限制了該法的臨床應(yīng)用。免疫印跡法為目前檢測ApoE表型最常用方法。此法直接用血清（或血漿)作為樣品，脫脂后進行IEF電泳，然后用特異性多克隆或單克隆抗體進行免疫印跡反應(yīng)，根據(jù)黑色后圖譜即可確定ApoE表型。此法比IEF法更省時、簡便、準(zhǔn)確。

1．儀器與試劑

電泳儀，垂直板式電泳槽，轉(zhuǎn)移電泳槽，NC膜；主要試劑有：⑴3：1（V/V)乙醚脫脂液；⑵樣品溶解液；0.01mol/l Tris,pH8.6,內(nèi)含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素；⑶兩性電解質(zhì)（Ampholine,pH4～6,LKB產(chǎn)品)；⑷丙烯酰胺（Acr)、N-N"甲叉雙丙烯酰胺（Bis)，Serva產(chǎn)品；⑸TEMED（Sigma產(chǎn)品)；⑹電泳緩沖液：1mol/lNaOH,1mol/L H₃PO₄；⑺轉(zhuǎn)移電泳緩沖液：含20%甲醇，39mmol/L甘氨酸，48mmol/lTris和0.0375%SDS；⑻洗滌液（TPBS)含0.05%吐溫-20，0.9%NaCl的10mmol/LPBS,pH7.4；⑼封閉液：含0.18%兔血清的TPBS或含3%BSA的TPBS；⑽羊抗人ApoE多克隆抗血清；⑾HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG：⑿4-氯-1-萘酚（Sigma產(chǎn)品)。

2．實驗方法

（1)樣品處理：抽取空腹血1～2ml，分離血清。取血清10μ置于預(yù)冷乙醇/乙醚（3：1)脫脂液中-20℃脫10h以上，離心（2500r/min)15min，棄上清后的加等量預(yù)冷的無水乙醚繼續(xù)脫脂0.5h，再次離心，將沉淀樣品用氮氣吹干或抽真空使殘余乙醚揮發(fā)；（2)IEF電泳：電泳前將樣本溶解在100μl溶解液中（0.01mol/l Tris,pH8.6,內(nèi)含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素)，放置37℃，1h。PAG凝膠濃度為5%，內(nèi)含尿素（8mol/L)，2%Ampholine,0.025%過硫酸胺（AP)及0.033%TEMED。電極液：陰極為1mol/LN_aOH，陽極為1mol/LH₃PO₄。每份樣品加樣20μl，IEF條件初為300V，0.5h,然后調(diào)至700V，電泳5h�；�1000V預(yù)冰30min（10℃)后，關(guān)電源，在靠陰極處放上IEF加樣箔，每一空內(nèi)加樣后，繼續(xù)電泳2h30min；（3)免疫印跡：轉(zhuǎn)移電泳條件18V/cm，按轉(zhuǎn)移電泳槽要求將凝膠上的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到NC膜上。5h后取出NC膜，放入封閉液內(nèi)，室溫過夜。用TPBS洗3次，然后用羊抗人ApoE抗血清（1：2000TPBS稀釋)室溫孵育6h。傾去液體，充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG（1：200)室溫孵育2h。用PBS洗膜3次，每次10min。稱取12mg4-氯-1-萘酚溶在4ml冷甲醇（-20℃)中，放入20mlPBS，加入10μ130%H₂O₂，放入已洗凈的NC膜，緩緩搖動至蛋白帶顯出，蒸餾水洗后，晾干，暗處保存；（4)ApoE表型判定：根據(jù)所顯示ApoE區(qū)帶圖譜即可確定ApoE表型，見圖19-4所示。

圖19-4 6種ApoE表型免疫印跡圖（模式)

此方法樣品用量少（10～20μl血清即可)，故特別適合臨床檢驗與大規(guī)模人群調(diào)查。由于ApoE糖類含量會影響IEF結(jié)果，所以在IEF前常用唾液酸酶預(yù)處理標(biāo)本，以除去唾液酸殘基。唾液酸酶的處理加強了主要區(qū)帶，減弱了干擾的唾液酸型區(qū)帶，克服了未用酶處理時，E3/2和E3/3有時難以分辨的困難，提高了表型判別的準(zhǔn)確性。另外，如選用pH4～8范圍的梯度作IEF電泳，則幾乎能檢測出至今為止所發(fā)現(xiàn)的所有異構(gòu)體表型。國內(nèi)呂新躍等應(yīng)用自制E₆C₃株ApoE單克隆抗體作為一抗，用兔抗鼠IgG-辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，建立微量脫脂血清IEF及免疫印跡檢測ApoE表型，亦取得較好效果。

四、ApoE基因型的檢測

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)，即PCR-RFLP技術(shù)從基因水平檢測ApoE基因多態(tài)性（基因型)，操作簡便、快速準(zhǔn)確。

1．儀器與試劑

（1)儀器：電泳儀、基因擴增儀；

（2)試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA參考物（pBR322DNA/HacⅢmarkers)、HhaⅠ，其余試劑均為分析純。

2．實驗方法

（1)引物的設(shè)計與合成：引物參考文獻(xiàn)設(shè)計，由Ranson Hill Bio Ssience Inc合成。序列為P1：5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’；P2：5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’。特異性擴增ApoE基因第4外顯子區(qū)含編碼112位與158位氨基酸的基因序列（如圖19-5)。產(chǎn)物片段292bp。

圖19-5 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)HhaⅠ酶切后RFLP模式

（2)模板DNA提取

①經(jīng)典法，取全血100μl，蛋白酶K消化，按標(biāo)準(zhǔn)酚、氯仿、異戊醇法提取DNA；②碘化鈉法，參照Loparev等法加以改良，取全血100μl加無菌雙蒸水100μl混勻，加6mol/lNaⅠ200μl渦旋震蕩30秒，加等體積氯仿/異戊醇（24：1)，渦旋震蕩30秒，離心后取上清加0.6體積異丙醇混勻，室溫（或4℃)靜置15min，離心后沉淀以37%異丙醇洗1次，晾干后溶于TE中。以上兩法提取DNA經(jīng)紫外分光光度計定量后，置-20℃保存?zhèn)溆茫虎畚⒘垦�斑水煮法，�?0μl全血點至無菌濾紙上，自然干燥后用甲醇固定，室溫貯存。臨用時，剪成一直徑5mm的圓形血斑紙塊，將其混至100μl無菌雙蒸水中，100℃煮沸30min以裂解細(xì)胞。取混合物15μl作膜板用。

（3)PCR擴增；反應(yīng)體系為50μl。其中含1×擴增緩沖液（Tris-HC167mmol,pH8.3；MgCl₂25mmol/L；KCl50mmol/L)5μl，1%二甲亞砜5μl，dNTP各200μmol/L（5μl)，引物P1、P2各5μl（分別為0.5μmol/L，模板DNA200mg（5μl)，雙蒸水15μl，加石蠟油30μl，離心混勻，置熱循環(huán)儀（PE2400型，Perkin Elmer Cetus)中95℃預(yù)變性12min后，再加入TaqDNA聚合酶2U（5μl)，然后按下列程序循環(huán)35次，即94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min,最后于72℃再延伸10min，取產(chǎn)物10μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（溴化乙啶)，紫外燈下觀察擴增為292bp。

（4)擴增產(chǎn)物的限制性酶切：PCR擴增產(chǎn)物17μl直接用10UHhaⅠ酶切，37℃消化4h。反應(yīng)終止后產(chǎn)物經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色35min，以DNA片段長度標(biāo)準(zhǔn)物為參考，紫外燈下觀察結(jié)果并照像。ApoE基因型判定參照Richard等方法加以簡化，即ε2/2出現(xiàn)3條帶（91bp,83bp,61bp)，ε3/2出現(xiàn)5條帶（91bp,83bp,61bp，48bp,35bp),ε3/3出現(xiàn)4條帶（91bp,61bp，48bp,35bp),ε4/3出現(xiàn)5條帶（91bp,83bp,61bp，48bp,35bp),（91bp,72bp,61bp,48bp,35bp)，ε4/2出現(xiàn)6條帶（91bp,83bp,72bp,61bp，48bp,35bp),ε4/4出現(xiàn)4條帶（72bp,61bp,48bp,35bp)。

該法檢測的ApoE基因型圖譜如表19-2所示。表中所示動脈粥樣硬化性腦梗死（ABI)。

表19-2 人ApoE基因型和等位基因頻率分布（%)

*：P＜0.05；**P＜0.01(均與對照組比較)

病人ε4/3基因型頻率（30.0%)與ε4等位基因頻率(18.0%)均顯著高于健康對照組。

五、ApoE表型檢測的臨床意義

臨床上對ApoE表型多態(tài)性的研究已有20多年的歷史，許多研究表明，ApoE多態(tài)性與個體患冠心�。–HD)或腦卒中可能存在某種內(nèi)在聯(lián)系。1993年以來，又發(fā)現(xiàn)ApoE多態(tài)性與AD及老化有關(guān)。通過對不同人群ApoE表型頻率分布差異、ApoE多態(tài)性對血脂水平的影響及在某些疾病狀態(tài)時ApoE等位基因頻率分布的系統(tǒng)深入研究，已取得許多研究成果。

1．人群ApoE表型人群中存在六種ApoE表型，其由位于一個基因位點的三個共顯性等位基因所控制。正常人群中以E3/3表型頻率最高（超過50%)；含E3的雜合子（E4/3、E3/2)居中（二者之和超過20%)；E2/2、E4/4和E4/2表型頻率最低（三者之和不超過8%)。

2．ApoE表型分布ApoE表型與等位基因頻率分布具有一定種族差異性（如表19-3)，無性別差異。中國人與日本人群十分相似，E₃頻率均高于80%，而歐美人群均低于80%。歐洲人E₄等位基因頻率從北到南呈下降梯度分布，亞洲人E₄頻率低（4.9%～12.7%)，相比之下，非洲黑人及巴布亞新幾內(nèi)亞人E₄頻率高（約分別為30%、36.8%)。

表19-3　不同國家人群ApoE表型及等位基因頻率分布

3．ApoE表型與高脂血癥 ApoE多態(tài)性可能與不同的高脂血癥（HLP)、CHD發(fā)生的種族差異及家族傾向有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)Ⅲ型HLP患者幾乎無例外的均為E2/2表型，易早發(fā)嚴(yán)重的AS。V型HLP患者ApoE4含量比正常人高。CHD患者E4/3表型和E4基因頻率明顯高于正常對照組。ε4與高TC、高LDL-C和高ApoB水平密切相關(guān)，可能是高膽固醇血癥和CHD的遺傳易患因子。

4．ApoE表型與腦病 ApoE多態(tài)性與缺血性腦血管�。↖CVD)關(guān)系密切。Pedro-Botet等研究發(fā)現(xiàn)ICVD組E4/3表型頻率明顯高于對照組，E3/3表型頻率明顯低于對照組，認(rèn)為ε4基因可能是ICVD的一種遺傳標(biāo)記。而Couderc等采用病例一對照的方法研究認(rèn)為ICVD組E3/3表型頻率明顯低于對照組，而E3/2明顯高于對照組，認(rèn)為ε2基因可能是ICVD的危險因素。這些結(jié)論之間的差異可能與研究方法、所選病例及研究人群之間差異有關(guān)。

5．ApoE表型與AD ApoE多態(tài)性是Alzheimer病（AD)危險性的重要決定因子。Shimaro等（1989)首先描述AD與ε4的關(guān)系，他們運用IEF研究發(fā)現(xiàn)AD患者ε4頻率比對照組高2倍。此后，Rose研究組等相繼報道遲發(fā)性家族性AD（FAD)病人ε4頻率增高，都描述、證實和討論了ε4與AD的關(guān)系。Schachter等（1994)率先報道百歲老人普遍拎攜帶ε2等位基因。高齡老人攜帶ε2數(shù)量是年輕人的2倍。因此，ε2基因似乎不僅可保護人們免患AD，而且還與長壽有關(guān)。