血清中膽固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下,可分別結(jié)合亞油酸(43%)、油酸(24%)、軟脂酸(10%)、亞麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸結(jié)合而成。血清中膽固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL、CM最少。血清總膽固醇測(cè)定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。
1.化學(xué)法
化學(xué)法一般包括:①抽提;②皂化;③毛地黃皂苷沉淀純化;④顯色比色四個(gè)階段。代表性的方法有Sperry-Webb法,通過①~④步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了②、③;蛘哂檬∪ア、③步驟的Zak-Henly法及省去③步驟的Abell-Kendall法,現(xiàn)將此法作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法予以引用。
2.酵法測(cè)定
CE在膽固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA,TC再經(jīng)膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)的應(yīng)用方法,快速準(zhǔn)確,標(biāo)本用量少,便于自動(dòng)生化分析儀作批量測(cè)定。
1.原理
血清加入醇溶性氫氧化鉀,使膽固醇從脂蛋白中分離出來,同時(shí)使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇,加石油醚振搖、抽提,使膽固醇移入石油醚層,分離并取一定量的石油醚層,蒸發(fā)至干,再進(jìn)行Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng),620nm比色定量。該法可用于基本功訓(xùn)練及組織細(xì)胞膽固醇的提取定量。
2.試劑組成
代號(hào) | 種類 | 濃度 | 組 成 | 貯存2~8℃ | 有效時(shí)間 |
R1 | 乙醇 | 優(yōu)質(zhì)純 | |||
R2 | 石油醚 | 沸點(diǎn)68℃,特級(jí)純 | |||
R3 | 水醋酸 | 分析純 | |||
R4 | 無水醋酸 | 膽固醇分析用,不含HCI | |||
R5 | 濃硫酸 | 分析純 | |||
R6 | KOH液 | 33%(W/W) | KOH10g+H2O20ml | ||
R7 | 乙醇性KOH液 | R194ml+R66ml | 臨用前配制 | ||
R8 | Liebermann | 配制后 | |||
Burchard | R420體積+R51體積+R310體積 | 1h | |||
試劑* | 內(nèi)用完bhskgw.cn/shouyi/ | ||||
R9 | 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液 | 5.17mmol/L | 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品200mg+R1→100ml | 0 |
*:在三角燒瓶?jī)?nèi),加入無水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入濃硫酸,混合,靜置10min,又加冰醋酸混勻,備用。
3.操作
圖15-1 血清膽固醇(Abell法)測(cè)定操作圖
按圖15-1操作。
4.計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶(CEH)水解為游離膽固醇和脂肪酸,膽固醇在膽固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-膽甾烯酮和H2O2,再H2O2經(jīng)過氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)參與下,生成紅色醌亞胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→紅色醌亞胺色素
(一)手工測(cè)定法
1.試劑組成
代號(hào) | 種類 | 濃度 | 組成 | 貯2~8℃ | 有效時(shí)間 |
Na2HPO4 | 50mmol/L | ||||
Na2H2PO4 | 50mmol/L | ||||
膽酸鈉 | 3mmol/L | ||||
4-氨基安替比林 | 0.82mmol/L | ||||
R1* | ESPAS | 14mmol/L | 24h | ||
Carbowax-6000 | 0.17mmol/L | ||||
CEH | 33U/L | ||||
COD | 117U/L | ||||
POD | 6700U/L | ||||
R2 | 標(biāo)準(zhǔn)液 | 5.17mmol/L | 用異丙醇溶解膽固醇 |
*混勻,調(diào)pH至6.70±0.10(25℃),或購買試劑盒。酶以活性單位表示。
2.操作
按圖15-2操作。
3.計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)總膽固醇濃度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自動(dòng)化分析儀測(cè)定
以CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)為例。
1.試劑組成
A液:CEH、POwww.med126.comD、抗壞血酸氧化酶等。
B液:COD、4-氨基安替比林等。
圖15-2 血清膽固醇測(cè)定(酶法)操作圖
2.上機(jī)參數(shù)
項(xiàng) 目 | 參 數(shù) |
方 法 | 終點(diǎn)法 |
波 長 | 雙波長(540nm,700nm) |
反應(yīng)溫度 | 37℃ |
試劑A反應(yīng)時(shí)間 | 2~3min |
試劑B反應(yīng)時(shí)間 | 5~6min |
樣本用量 | 3μl |
試劑A用量 | 250μl |
試劑B用量 | 120μl |
單位 | mmol/L |
3.操作過程
4.計(jì)算
以△A=A2-A1,根據(jù)同樣處理之標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)控物計(jì)算,打印結(jié)果。
5.注意事項(xiàng)
(1)試劑與樣本量可根據(jù)分析儀要求按比例改變。
(2)試劑在有效內(nèi)2~8℃避光食保存。
(3)膽固醇含量超過200mmol/L,需用生理鹽水稀釋再測(cè)。