放射免疫分析時加入的抗原和抗體的量極微，反應所形成的復合物并不能成為肉眼所能辨認的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必須分別測量與抗體結合的（B)和游離的（F)抗原，所以，B、F的分離是放射免疫分析中的一個重要環(huán)節(jié) 。根據(jù)抗原—抗體復合物與游離抗原理化性質或免疫學性質的不同，可采取各種分離技術。
分離方法的選擇直接影響分析的質量，通常需滿足以下要求：
①使B和F分離完全；②不受外界因素的干擾而影響分離效果；③與游離抗原的非特異性作用盡可能��；④操作簡便，分離迅速，重復性好，適用于大量樣品分析；⑤來源廣，價格低廉，便于使用，適合RIA技術自動化。
目前用于放射免疫測定中的分離方法很多，各有其優(yōu)缺點，下面介紹幾種常見的分離方法：
（1)吸附分離（固相顆粒)
活性碳吸附劑（目前常用)
硅鎂吸附劑（滑石粉等)
交換樹脂吸附劑
（2)蛋白沉淀劑
硫酸銨、硫酸鈉
聚乙二醇（PEG)（目前常用)
無水乙醇、丙醇等
（3)免疫分離劑（第二抗體)
（4)磁性分離劑
磁化活性碳吸附劑
磁化固相抗體
（5)固相包被分離法（固相分離劑包被在測試管內(nèi))
（一)吸附分離法
這種吸附分離劑是固相顆粒，它可以從反應液中吸附游離抗原。
活性炭是常用的吸附劑�；钚蕴慷嘤糜谛》肿佑坞x抗原和抗原—抗體復合物的分離。具體應用時在活懷炭顆粒的表面涂上一層右旋糖酐或蛋白類化合物。這樣活性炭末的表面構成一定大小的孔洞，在反應液中加入這種特殊顆粒的混懸液時，小分子的游離抗原被活性炭吸附，達到分離B與F的目的。
活性炭吸附方法的優(yōu)點是操作簡便、價廉，缺點是離心沉淀部分是F而不是B，不適用目前自動化放免測定，分離時易受溫度和時間的影響。
（二)沉淀分離法
沉淀分離法的原理，是鹽類或有機溶劑能夠破壞蛋白質分子表面的水化層而發(fā)生沉淀（這種分離要求蛋白質分子處在等電點環(huán)境中)。常用的沉淀劑是聚乙二醇（PEG)。PEG是一種直鏈大分子聚合物，使用PEG溶液時分離沉淀是在有載體血清蛋白或丙種蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最終濃度達250mg/ml以上的情況下才能實現(xiàn)。PEG沉淀的結果易受過量的脂類或離心溫度的變化影響，PEG離心溫度在20℃以下進行。PEG沉淀的優(yōu)點是PEG價格低廉，操作簡便，一次可處理大量樣品。其缺點是PEG單獨使用時非特異結合高，所以常與其它方法聯(lián)合使用；其分離效果易受pH、溫度等影響。
（三)雙抗體分離法
雙抗體分離法也稱免疫分離法，是特異性分離，應用十分普遍。本法是以抗IgG抗體和可溶性的抗原-抗體復合物結合，形成很大的復合物而沉淀。很多抗原的特異抗體來自家兔或豚鼠，稱為第一抗體，形成的復合物不能通過離心將其沉淀。或將第一抗體的同種正常動物的血清IgG免疫另一種動物所制得的抗體為第二抗體，該抗體與第一抗體形成不可溶的復合物，經(jīng)離心可將其沉淀，從而達到分離的目的（圖8-6)。
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圖8-6 雙抗體法分離原理模式圖
第二抗體分離的優(yōu)點是重復性好，B和F分離較為完全，非特異結合低，可同時處理大量樣品，使用方便。缺點是分離時間長，非特異性結合可有較大的波動，第二抗體用量較大。
（四)磁性分離法
1975年，Hersh報道了用磁化分離技術分離血清狄高辛放免測定的B、F后，受到了廣泛的重視。近年來國內(nèi)外許多學者對磁化顆粒的制備進行了系統(tǒng)地研究，應用于B與F的分離，并取得了引人注目的進展，使放免的B、F分離不再使用離心，縮短了放免操作bhskgw.cn/wszg/時間，便于放免自動化測量。磁性分離的具體原理為血清樣品與標準品中的抗原與磁顆粒上的一定量的抗體反應，產(chǎn)生的抗原抗體磁性顆粒復合物，在磁場作用下沉降，使結合部分與游離部分分離。在磁性分離器上棄上清，進行測量。優(yōu)點是簡化了操作程序，B、F分離也較完全，穩(wěn)定性好。
目前常用的磁性分離技術除磁性固相抗體外，還有磁化活性炭吸附分離劑。
（五)固相包被分離法
近年來由于固相技術的研究使其固相所被（埋)技術發(fā)展迅速，再有固相包被具有簡便、快速、穩(wěn)定、不需離心等優(yōu)點，有逐漸取代液相法的趨勢。
1990年，Causse報告了活化塑料管新技術及生物素結合抗體、親和素標記物的應用，使放免技術對多數(shù)微量物質的檢測可達到10-15g級水平，大大提高了放免測定的精確度、靈敏度。
抗體包被：物理吸附法—方法簡便，但包被量低。
價鍵結合法—需要纖維素、瓊脂等固相載體，操作復雜。
Causse活化塑料管新技術，提高了包被量，主要特點是將順丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚體涂布試管，在試管壁形成一層活性薄膜（這種方法操作簡便)。
（六)雙抗體+PEG的分離法
這種分離方法利用雙抗體特異性強、PEG沉淀簡便快速的優(yōu)點，從而克服了雙抗體時間長、PEG方法bhskgw.cn非特異結合高的缺點。這一方面是當前分離技術中較理想的一種方法。
這種聯(lián)合方法分離方法減少了第二抗體的用量，PEG的最終濃度也只需2～4%，成本較低。這種方法既適用于蛋白質、酶、大分子物質，又適用于小分子肽等半抗原物質。
1991年，北京中國同位素公司北方免疫試劑所采用80年代法國廣泛應用的雙抗體+PEG、再加一定劑量的γ球蛋白（免疫第二抗體時應用的γ球蛋白)的分離劑，溶解于磷酸緩沖液中，pH在7.4左右。這種分離劑推廣應用產(chǎn)生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特異性結合低，時間短（加入分離劑15min后即可離心)，受溫度影響小，受到用戶的廣泛好評。
以上方法，要依據(jù)反應液中反應物分子量大小，酸堿度等特點，選擇合適的分離方法及分離劑。
