免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第三節(jié)　免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開(kāi)，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳技術(shù)的種類(lèi)很多，這里僅將常用的技術(shù)介紹如下。

一、免疫電泳

免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴(kuò)散的結(jié)合，是由Grabar和Williams（1953)首先報(bào)道的。方法是先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將不同電荷和分子量的蛋白抗原在瓊脂內(nèi)分離開(kāi)，然后與電泳方向平行在兩側(cè)開(kāi)槽，加入抗血清。置室溫或37℃使兩者擴(kuò)散，各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體反應(yīng)形成弧形沉淀線(xiàn)（圖12-8)。根據(jù)各蛋白所處的電泳位置，可分為白蛋白區(qū)、球蛋白α1區(qū)、α2區(qū)、β區(qū)和γ區(qū)。各區(qū)帶常見(jiàn)血漿蛋白見(jiàn)表12-3和圖12-9。

圖12-8免疫電泳擴(kuò)散模式圖A1b：白蛋白

表12-3血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分

圖12-9血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖

PreALB：前白蛋白；HP：觸珠蛋白；α₁脂蛋白；ALB：白蛋白；TRF：轉(zhuǎn)鐵蛋白

βLIP：β脂蛋白；AAT：抗胰蛋白酶；AAG：酸糖蛋白；α₂M：α₂巨球蛋白

免疫電泳沉淀線(xiàn)的數(shù)目和分辨率受許多因素影響。首先是抗原與抗體的比例，同其它沉淀反應(yīng)一樣，要預(yù)測(cè)抗體與抗原的最適比；其次是抗血清的抗體譜，一只動(dòng)物的抗血清往往缺乏某些抗體，如將幾只動(dòng)物或幾種動(dòng)物的抗血清混合使用，則效果更好；電泳條件，如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線(xiàn)的分辨率。對(duì)于免疫電泳的分析，更重要的是經(jīng)驗(yàn)的積累，只有多看，多對(duì)比分析，才能作出恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論。

免疫電泳目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識(shí)別等方面。

二、對(duì)流免疫電泳

對(duì)流免疫電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴(kuò)散技術(shù)，其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測(cè)抗原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽(yáng)極側(cè)。通電后，帶負(fù)電荷的抗原泳向陽(yáng)極抗體側(cè)，而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在兩者之間或抗體的另一側(cè)（抗原過(guò)量時(shí))形成沉淀線(xiàn)（圖12-10).

圖12-10對(duì)流電泳結(jié)果示意圖

①Ag為陽(yáng)性；②A(yíng)g為弱陽(yáng)性；③Ag為強(qiáng)陽(yáng)性；④Ag為強(qiáng)陽(yáng)性

IgG作為蛋白質(zhì)在電泳中比較特殊，4個(gè)亞型有不同的表現(xiàn)。G3和G4與一般蛋白無(wú)異，泳向陽(yáng)極；而G1和G2則因其帶電荷少，受電滲的作用力大于電泳，所以被水分子攜裹向陰極移動(dòng)。這就形成了IgG的特殊電泳形式：一部分泳向陽(yáng)極，另一部分泳向陰極，www.med126.com在抗體孔兩側(cè)皆有抗體存在。因此，所謂對(duì)流只是部分IgG的電滲作用造成。

三、火箭免疫電泳

火箭免疫電泳技術(shù)又稱(chēng)作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測(cè)標(biāo)本后，將bhskgw.cn/wsj/抗原置陰極端，用橫距2～3mA/cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳�？乖�泳向陽(yáng)極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭（圖12-11)。抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標(biāo)本中的抗原含量。

圖12-11火箭電泳圖

①②③為標(biāo)本；④⑤⑥為標(biāo)準(zhǔn)抗原

火箭電泳操作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1．所用瓊脂可選擇無(wú)電滲或電滲很小的，否則火箭形狀不規(guī)則。

2．注意電泳終點(diǎn)時(shí)間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達(dá)終點(diǎn)。

3．標(biāo)本數(shù)量多時(shí)，電泳板應(yīng)先置電泳槽上，搭橋并開(kāi)啟電源（電流要小)后再加樣。否則易形成寬底峰形，使定量不準(zhǔn)。

4．作IgG定量時(shí)，由于抗原和抗體的性質(zhì)相同，火箭峰因電滲呈紡綞狀。為了糾正這種現(xiàn)象，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲�；�)，使本來(lái)帶兩性電荷的IgG變?yōu)橹粠щ姾桑�加快了電泳速度，抵消了電滲作用，而出現(xiàn)伸向陽(yáng)極的火箭峰。

火箭電泳作為抗原定量只能測(cè)定μg/ml以上的含量，如低于此水平則難于形成可見(jiàn)的沉淀峰。加入少量¹²⁵I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見(jiàn)的放射自顯影技術(shù)。根據(jù)自顯影火箭峰降低的程度（競(jìng)爭(zhēng)法)可計(jì)算出抗原的濃度。放射免疫自顯影技術(shù)可測(cè)出ng/ml的抗原濃度。

四、免疫固定電泳

免疫固定電泳（immunofixationelectrophoresis，IFE)是Alper和Johnson（1969)推薦的一項(xiàng)有實(shí)用價(jià)值的電泳加沉淀反應(yīng)技術(shù)�？捎糜诟鞣N蛋白質(zhì)的鑒定。該法原理類(lèi)似免疫電泳，不同之處是將血清直接加于電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，或?qū)⒔�有抗血清的濾紙貼于其上，抗原與對(duì)應(yīng)抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成的復(fù)合物嵌于固相支持物中。將未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則出現(xiàn)被結(jié)合固定的某種蛋白。區(qū)帶電泳支持物選用濾紙、醋纖膜、瓊脂或聚丙烯酰胺皆可。

免疫固定電泳最常用于M蛋白的鑒定。方法是：先將患者血清或血漿在醋纖膜上或瓊脂上作區(qū)帶電泳（一般作6條標(biāo)本)，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后取下，加抗血清，由上而下依次加抗人全血清、抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗κ輕鏈和抗λ輕鏈。必要時(shí)還可加抗Fab、抗Fc等特殊抗血清。作用30min后洗去游離蛋白質(zhì)，染色后則可被固定的相應(yīng)M蛋白成分。