近年 ICC技術(shù)在下述方面的應(yīng)用，令人注目，有著廣闊的前景�，F(xiàn)介紹如下：
鋪片（Whole Mount Stretch Preparation) 是研究神經(jīng)分布應(yīng)用較早、較廣的方法。19世紀(jì)末，Dogiel和Cajal等利用鋪片技術(shù)，結(jié)合鍍銀及甲基藍染色，觀察腸道神經(jīng)叢模式、神經(jīng)元種類及其相關(guān)聯(lián)的間質(zhì)細胞。近年來，人們進一步認(rèn)識到全層鋪片技術(shù)的優(yōu)點：例如①不必采用連續(xù)切片和三維重建技術(shù)，可以直接觀察神經(jīng)元間質(zhì)細胞的三維結(jié)構(gòu)；②能觀察較大區(qū)域，在研究顯微外科手術(shù)后神經(jīng)分布模式和數(shù)量改變中有較好的應(yīng)用價值；③操作簡單，能在較短時間內(nèi)制作大量標(biāo)本等。所以，鋪片技術(shù)在ICC染色中得到廣泛的采用（Zhou等1992)
鋪片ICC染色方法與切片基本相同，所不同的是鋪片較厚，背景著色較強，有時甚至妨礙特異性染色的觀察。實驗證明，這種非特異性染色主要是酶標(biāo)抗體/橋抗體與組織γ-球蛋白結(jié)合引起的，用封閉性阻斷劑及正常血清等分別孵育切片，并在稀釋抗體時，加入適量的BSA，可以降低此類非特異性結(jié)合。BSA、封閉性阻斷劑與IgG（正常血清)的等電點不同，重疊應(yīng)用，阻斷效果尤佳。另外，鋪片的細胞膜完整，不利于抗體的穿透，特別是PAP復(fù)合物等大分子物質(zhì)，為此設(shè)法提高抗體的穿透性是非常重要的。采用反復(fù)凍融和表面活性劑前處理，有助于細胞內(nèi)抗原的暴露。我們在實驗中參考Costa(1980)的制片方法，將組織鋪片經(jīng)系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次10～15min)脫水，Hemo—d 2次（10～15in/次)，再水化（100%、90%、70%、50%降酒精)等處理，輔助Triton X-100應(yīng)用，明顯增加抗體的穿透性，獲得較為滿意的染色效果�！〉�，并非所有的組織都能制成鋪片，虹膜、腸系膜和小血管等適于制做全層鋪片；食道、胃腸道、膽道、膽囊、大血管、輸尿管等臟器則均需進行組織分層，再鋪片，行ICC染色。
染色方法：以小腸分層鋪片為例：
（1)4%多聚甲醛或Zamboni 液固定2～6h，4℃，或丙酮固定。
（2)PBS充分沖洗，置PBS中過夜。
（3)系列酒精脫水，Hemo—D透明，降酒精至PBS。
（4)分層鋪片，直接漂浮染色或貼于載玻片風(fēng)干，再染色。
（5)0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室溫，PBS沖洗。
（6)封閉性阻斷劑30in，室溫，正常兔（羊)血清30min，室溫。
（7)第一抗體，孵育，4℃冰箱過夜；PBS2次/2min；重復(fù)第一抗體孵育（可稀釋1
倍)，2～3h，室溫，充分使抗體穿透至深層，使組織深層的抗原得以與抗體充分結(jié)合。
（8)PBS充分沖洗，2～3h，4℃。
（9)酶標(biāo)抗體孵育，4℃冰箱過夜。
（10)PBS沖洗，呈色，觀察與切片相同。
在某些物質(zhì)活性檢測、神經(jīng)遞質(zhì)共存的研究、臨床腫瘤的分型、定性，以及預(yù)后的估測等中，ICC顯示了巨大的優(yōu)勢，它不僅能與Carbon、熒光色素、同位素追蹤標(biāo)記及其它組織化學(xué)方法（例如PAS染色法)結(jié)合，顯示兩種物質(zhì)的共存，提示組織細胞的功能，而且本身亦可進行雙重染色，研究一些抗原物質(zhì)的共存，這里僅簡單介紹ICC雙重染色的幾種方法。
1．連續(xù)切片（Serial sectioning technique) 連續(xù)切片是兩種物質(zhì)共存研究中應(yīng)用最早的方法之一，是用相鄰切片分別孵育兩種不同特異性抗體進行ICC染色，主要適用于觀察同一細胞內(nèi)不同抗原的分布。該方法要求切片足夠薄，保證每個細胞能同時出現(xiàn)在3～4張相鄰切片上，第1和3張切片用相同抗體染色均陽性時，作為陽性結(jié)果，可信度較高，可避免結(jié)果判斷困難。所以，常采用石蠟切片，厚約2μm左右，若用樹脂包埋的半薄切片（0.5～1μm)，比較容易識別同一細胞內(nèi)兩種抗原的共存。
2．鏡影切片法（Mirror sectioning technique) 所謂鏡影切片，簡單地講就是兩張相鄰的石蠟切片（厚2μm)或冰凍切片（厚3～4μm)，第二張反轉(zhuǎn)之，貼于載玻片上，同一細胞在兩張相鄰的切片上呈鏡與影的關(guān)系（相當(dāng)于冰凍蝕刻電鏡的P面和E面)。分別孵育兩種不同抗體，ICC染色，觀察其在同一細胞內(nèi)的分布。
1．ICC與熒光抗體法結(jié)合 首先染色顯示A抗原，DAB/H2O2呈色，繼之用間接（直接)熒光抗體法顯示B抗原，于光鏡和熒光顯微鏡下觀察，比較兩種抗原的分布。因DAB終產(chǎn)物能夠沿其表面向周圍遷移，尤其是DAB濃度略高、反應(yīng)時間稍長時，形成的終產(chǎn)物較大，可以遮蓋該抗原抗體的反應(yīng)部位，故兩種染色間很少出現(xiàn)交叉反應(yīng)。該雙重染色的方法主要適于顯示兩種抗原分布不同細胞內(nèi)，尤其A抗原濃度高、反應(yīng)較強、DAB終產(chǎn)物較牢固的情況。
2．同一切片的再度染色法（Restanining Method) 用ICC法顯示神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等在神經(jīng)細胞/神經(jīng)纖維內(nèi)共存時，連續(xù)切片、鏡影切片及重疊染色往往很難判斷同一神經(jīng)纖維的共染，為此建立了同一切片再度染色法。該方法利用4—氯—1—萘酚（CN)產(chǎn)物在酒精內(nèi)的可溶性及酸處理能使抗原抗體解離的特點，首先第一種抗原用CN發(fā)色，染色陽性部位攝影；繼之，用低 pH的甘氨酸/鹽酸緩沖液（0.2mol/L甘氨酸—鹽酸緩沖液，pH2.2～2.3,含0.5mol/l NaCl)或鹽酸孵育切片，去除第一次染色的抗體，再經(jīng)50%、70%、90%、100%酒精脫CN色，PBS洗凈后染色第二種抗原，DAB呈色后，攝影比較同一部位是否兩種抗原共存在于同一神經(jīng)纖維。為驗證鹽酸等處理效果，可省略第二次染色的特異性抗體，僅重復(fù)酶標(biāo)抗體的染色，觀察第一抗原陽性部位是否出現(xiàn)重疊著色。
3．同一切片、不同呈色的雙重染色ICC法顯示A抗原時，用DAB/H2O2呈色，終產(chǎn)物為棕褐色；繼之，B抗原染色，CN/H2O2呈色，反應(yīng)產(chǎn)物深藍色，光鏡下可同時觀察兩種抗原的局部所在。為避免第二次染色的抗體與第一次染色抗體之間的交叉反應(yīng)，在B抗原染色前，可用酸性緩沖液處理切片，去除第一次反應(yīng)的抗體，方法同2。該方法DAB和CN的色彩對比不鮮明，而且HRP酶活性較強，酸性緩沖液中，亦能殘存部位活性，所以可能有混合顏色出現(xiàn)，判定同一細胞內(nèi)兩種抗原共存常常有一定難度。
4．兩種酶標(biāo)抗體的雙重染色 分別用HRP和ALP標(biāo)記間接抗體，ICC染色，顯示兩種不同的抗原。首先顯示A抗原，HRP酶標(biāo)記間接抗體，CN/H2O2呈色；繼之顯示B抗原，ALP標(biāo)記間接抗體，F(xiàn)R/As—Mx呈色，輕度甲基綠/蘇木精復(fù)染細胞核，一般可獲得理想的結(jié)果，組織結(jié)構(gòu)清晰，色彩對比鮮明。筆者應(yīng)用此方法，顯示小鼠脾臟巨噬細胞標(biāo)記物ED1、ED2和ED3分布時，得到了較佳的染色效果。盡管該雙重染色法應(yīng)用了不同的酶標(biāo)抗體，但常用其二者來自同一種屬的抗體，所以在第一次染色部位，往往有重疊染色的現(xiàn)象。我們的經(jīng)驗為先染色反應(yīng)較弱、含量較少的抗原，第一抗體用較高稀釋度，酶標(biāo)抗體則用高濃度（低稀釋度)，盡量使所有的第一抗體均被飽和，防止其與第二種酶標(biāo)抗體結(jié)合；第二種抗體染色前，應(yīng)用PBS充分洗凈；第二種酶標(biāo)抗體可用較高的稀釋度。這樣可避免“非特異”性重疊著色，色彩對比亦較理想。
5．不同種屬來源的抗體的雙重染色上述幾種雙重染色法，均系來自同一種屬的特異抗體和相同/不同的酶標(biāo)抗體，所以兩次染色間常常有交叉反應(yīng)。較理想的方法是用不同種屬動物制備特異性抗體和兩種酶標(biāo)抗體的雙重染色，例如顯示A抗原為小鼠單克隆抗體，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG；顯示B抗原為豚鼠單克隆抗體，ALP標(biāo)記羊（驢)抗豚鼠IgG ，將兩種抗體稀釋最佳工作液濃度1/2，充分混合、孵育同一張切片，亦可分別染色。CN/H2O2呈色后，F(xiàn)R—As—Mx呈色，光鏡下觀察兩種抗原的分布。該方法兩種抗體間無交叉反應(yīng)，特異性較高，即使細胞內(nèi)抗原量較少也能發(fā)現(xiàn)。但當(dāng)兩種抗原存在同一部位，其中之一濃度較高、占絕對優(yōu)勢時，亦將妨礙另一種抗原的染色，此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。該方法要分別制備4種不同的特異性抗體和酶標(biāo)抗體，費時費力，實際應(yīng)用受一定限制。
上述兩種雙重染色，兩種酶標(biāo)抗體的非特異性著色可能迭加，致使背景著色較單獨使用時增強，S/N下降，所以各研究室應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康暮蜅l件，合理選擇染色方法為宜。簡述染色步驟如下：
（1)切片準(zhǔn)備同一般間接法。
（2)切片孵育A抗原，特異抗體1～2h室溫。
（3)PBS沖洗，孵育HRP標(biāo)記抗體45min，室溫。
（4)PBS沖洗，孵育B抗原的特異抗體1～2h，室溫。充分漂洗，孵育ALP標(biāo)記抗體，45～60min。
（5)PBS沖洗，Baker’液固定5min，室溫，PBS洗凈。
（6)呈色CN/H2O2/TBS 15min，室溫。
（7)Tris—HCl(pH9.0)沖洗后，F(xiàn)r AS—Mx呈色8min,37℃。
（8)輕度PBS沖洗，1%戊二 醛固定5min。
（9)水洗，輕度復(fù)染細胞核，水溶性封固劑封片。
（10)光鏡下觀察。雙重標(biāo)記細胞呈暗紅至深紫色，與單獨陽性細胞有明顯區(qū)別。
形態(tài)學(xué)研究目的之一是揭示組織細胞結(jié)構(gòu)特征及其功能意義。利用ICC顯示給與細胞增殖標(biāo)記物，是組織細胞學(xué)研究中形態(tài)和功能相結(jié)合的重要手段之一。目前常用的細胞增殖標(biāo)記物有4種，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNApolymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen),Ki—67 等，相對應(yīng)的4種單克隆抗體均有商品出售。因組織細胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣。Brdu為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期)，活體注射或細胞培養(yǎng)加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結(jié)合其它細胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學(xué)有重要意義。
筆者在觀察大鼠小腸上皮細胞增殖、代謝時，一次腹腔注射Brdu（Sbhskgw.cn/Article/igma)4mg/150～200g體重，分別在給藥后1h和1、2、3、5、7天取小腸，應(yīng)用抗Brdu抗體，ICC染色，可見腸上皮細胞從腸腺至絨毛頂端增生移行。在計數(shù)免疫活性細胞研究中，一次注射Brdu后，計數(shù)瞬間進入S期細胞數(shù)或連續(xù)多次注射Brdu，計數(shù)注射Brdu期間進入S期細胞的總和。另外在臨床上，術(shù)前或術(shù)中給與Brdu，判斷腦腫瘤細胞分化程度、惡性度等亦較常用。
摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu，以氫鏈與腺嘌呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu抗體反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單克隆抗體與增殖細胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體孵育、呈色，顯示進入S期細胞的情況。
鹽酸和蛋白酶處理等可引起其它抗原或組織形態(tài)發(fā)生變化。為此，Conchoroff(1985)等制備了一種單克隆抗體（Bu—1)，其培養(yǎng)液上清能與雙鏈DNA的Brdu反應(yīng)，因為培養(yǎng)液上清中含有DNA酶，可分解www.med126.com雙鏈DNA，顯露Brdu，達到染色目的。筆者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—鹽酸處理，亦得到了良好的染色結(jié)果。簡述染色步驟如下（Matsuna,1989)：
（1)冰凍切片/石蠟切片準(zhǔn)備同前。
（2)TBS沖洗，Baker’s液固定10min，室溫。
（3)TBS沖洗，1%戊二醛固定5～10min，室溫。
（4)雙蒸水沖洗，0.006%(冰凍切片)或0.02%(石蠟切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。
（5)雙蒸水沖洗，4N HCl 30min，室溫。
（6)PBS充分沖洗，使切片pH回至中性。
（7)封閉性阻斷劑20min，室溫。
（8)抗Brdu抗體孵育1～2h室溫或4℃過夜。
（9)PBS沖洗，HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體45min，室溫。
（10)PBS沖洗，DAB/H2O2呈色。
（11)輕度蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片同前。分裂增殖細胞核呈棕褐色。
采用雙重或多重染色、觀察何種細胞分裂增殖時，首先應(yīng)染色其它抗原物質(zhì)，最后顯示Brdu。通常在第一種抗體呈色后，再經(jīng)1%戊二醛固定5～10min，重復(fù)上述程序，均可獲得較滿意的染色結(jié)果，分裂細胞核呈棕褐色；顯示其它抗原用ALP標(biāo)記抗體，則細胞漿為紅色（FR)或藍色（FB)。
傳統(tǒng)的ICC法主要用于檢測組織細胞中含有何種物質(zhì)，根據(jù)該物質(zhì)的作用，推測其組織細胞生理、病理意義。但該物質(zhì)來自何處，是否是陽性細胞合成往往較難判斷，結(jié)合免疫電鏡及雙重染色等方法，在某種程度上，有助于推斷該物質(zhì)的來源。然而通常ICC法顯示的是組織細胞已經(jīng)合成的物質(zhì)（過去時)，本身不能說明陽性組織細胞目前的功能狀態(tài)，亦無法預(yù)測細胞將合成何種物質(zhì)，發(fā)揮什么功能，因此，單純的ICC法存在著被動性。
近年來，ICC法與原位雜交技術(shù)結(jié)合，使細胞內(nèi)活性DNA可視化，直接顯示某染色體上，何種基因活性化或非活性化，描述組織細胞現(xiàn)在的狀態(tài)，同時亦可預(yù)知未來組織細胞將合成何種物質(zhì)，發(fā)揮哪些功能等，直接觀察組織細胞的時空改變，這在病理生理研究中有著重要意義，為形態(tài)學(xué)研究開辟了令人矚目的前景。
眾所周知，機體內(nèi)不同的蛋白質(zhì)發(fā)揮其特定的功能，與其氨基酸序列密切相關(guān)，而它的氨基酸序列又是DNA通過mRNA轉(zhuǎn)錄控制的。因此檢測該DAN/mRNA的分布，可判斷組織細胞的功能狀態(tài)。為在組織細胞水平檢測DNA/mRNA等一定堿基序列的核酸存在與否，Gall（1969)等建立了原位雜交方法（詳見第二十章 )。
在檢測某種特定的蛋白質(zhì)在哪一類細胞內(nèi)合成時，常常應(yīng)用連續(xù)切片或鏡影切片，原位雜交法顯示合成該蛋白質(zhì)的mRNA，ICC法染色其蛋白質(zhì)抗原，二者存在于同一細胞時，具有較強的說服力。同一切片進行上述雙重染色時，原位雜交步驟中，大多數(shù)抗原物質(zhì)的抗原性往往易被破壞，所以最好在ICC染色后再進行原位雜交染色。ICC染色中，抗體內(nèi)含有RNase等可能破壞細胞內(nèi)的mRNA，為此應(yīng)選用精制IgG抗體，并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖，其化學(xué)性質(zhì)與核酸類似，能夠與以核酸為底物的酶（RNase)結(jié)合，從而保護mRNA免受破壞。另外，ICC染色以DAB呈色時，核酸探針易吸附于DAB產(chǎn)物上，需注意。
近年隨著細胞工程的進步，ICC、原位雜交技術(shù)將在細胞生物學(xué)、組織學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、臨床疾病診斷等各個領(lǐng)域，得到更廣泛地應(yīng)用。
