實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　熒光抗體的制備

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熒光抗體是免疫熒光細胞化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備高特異性和高效價的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性高效價的免疫血清。一、熒光素熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止（一般持續(xù)10-7～10-8s）。可以產(chǎn)生明亮…

熒光抗體是免疫熒光細胞化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備高特異性和高效價的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性高效價的免疫血清。

一、熒光素

熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止（一般持續(xù)10-7～10-8s)�？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)，稱熒光色素。目前主要常用的熒光色素有以下3種：

（一)異硫氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate, GITC)

呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為398.4（圖3-5)。

在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。反應(yīng)式如下（圖3-6)：

一個Ig分子上最多能標記15～20個FITC分子。

圖3-5　FITC的吸收光譜和發(fā)射光譜

圖3-6　抗體的FITC標記反應(yīng)式

（二)四乙基羅達明（tetraethylrodamineB200, RB200)

呈褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595～600nm,呈明亮橙紅色熒光。分子量為580（圖3-7)。

RB200在五氯化磷（PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl)，在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸ε-氨基反應(yīng)結(jié)合而標記在蛋白分子上�；瘜W(xué)反應(yīng)式如下（圖3-8)。

圖3-7　RB200在可見光區(qū)的吸收

圖3-8　RB200標記抗體反應(yīng)光譜和熒光光譜

（三)四甲基異硫氰酸羅達明（tetramethylrhodamineisothiocyanate, TMRITC)

它是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清bhskgw.cn/shiti/晰（圖3-9)，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同TITC。它可用于雙標記示蹤研究�；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下（圖3-10)。

圖3-9　TMRITC在可見光區(qū)的吸收光譜和發(fā)射光譜

圖3-10　 TMRITC結(jié)構(gòu)式

二、熒光素標記抗體的方法

（一)FITC標記抗體的方法

1．Marsshall 氏法

（1)材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml)、冰及冰槽（或1000ml燒杯)、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。

（2)方法及步驟：

①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜)5～10min。

②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。

③結(jié)合（或稱標記)：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完)，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。

④透析：結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃)過夜。

⑤過柱：取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定（圖3-11，圖-3-12)。

圖3-11　 Sephadex G-25 對FITC

圖3-12　FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時結(jié)合的動力學(xué)（Kawamura 1964)

洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2);過濾量:12ml標記全球蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍)。

分別以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和pH9.0)，于2℃下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。間隔一定時間后各取出0.5ml通過sephadex G-25去游離FITC，由上計算出5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。

2．Chadwick 氏法

（1)材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶（25ml)、冰槽、無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml)、透析袋、棉線、玻棒等。

（2)方法及步驟：

①抗體準備：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入三角燒瓶內(nèi)，放于冰槽中。

②熒光色素準備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。

③將準備之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在0～4℃，冰箱中結(jié)合18～24h。

④透析和柱層析：方法同Marshall 氏法。

3．改良法（1963年) 　根據(jù)Marshall 氏法取高價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol/l NaCl)及緩沖液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0) 稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素=50～80mg:1mg)，在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然后用半飽和和硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃)可以用半年以上，-20℃保存可達2年以上。

【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCbhskgw.cn/wszg/l 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。

【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。

【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水重碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。

4．透析標記法此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。

（1)用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。

（2)用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4℃中（圖3-13)。

圖3-13　標記抗體溶液通過sephadex 產(chǎn)膠柱層析分布

（二)四乙基羅達明標記抗體方法

取1g RB200及PCL52g放在乳缽中研磨5min（在通風櫥中)。然后加入10ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進行標記抗體。剩余部分吸附在濾紙上，4℃干燥保存。

取抗體（20mg/ml)每毫升加入生理鹽水和0.5mol/l pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1ml RB200溶液，邊加入邊攪拌，在0～4℃中結(jié)合12～18h，再用生理鹽水透析5～7h，經(jīng)葡聚糖凝膠G-50柱層析，除去游離熒光素，分裝，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（三)四甲基異硫氰酸羅達明標記抗體方法

（1)Igg 10ml (6mg/ml)在0.01mol/l pH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。

（2)將四甲基異硫近氰酸羅達明（每毫克IgG加入5～20μg)溶于二甲亞砜（1mg/ml),取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白質(zhì)溶液中，同時電磁攪拌。

（3)在室溫中攪拌2h，避光。

（4)把結(jié)合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6層析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡過)，流速為1.5ml/min。

（5)收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標記抗體，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（四)藻紅蛋白標記抗體的方法

1．巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin PE)的制備，600μl的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺（iminothiolane hydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，裝入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個PE分子中可結(jié)合8個巰基。

2．PE-IgG制備異雙功能試劑SPDP[n - Succ - inimdyl3-(2-pyridyldlthio) propinate ] 30μl (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5)，在室溫中反應(yīng)2.5h。再加入巰基化Pe 400μl（1.7mg/ml)加到500μl反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，用PB透析過夜，4℃。加入0.01%Na3N3分裝，4℃保存半年。

（五)PE-標記蛋白A方法

（1)取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl)1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液（2.65mg/ml),SPDP/蛋白摩爾比為10，22℃反應(yīng)5min，過Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl)平衡和洗脫。

（2)0.5ml蛋白（2mg/ml)100mmol/l PB(含有100mmol/l NaCl) pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫蘇糖醇（DTT)pH7.4緩沖液，22℃，25min，同上過Sephadex G-50，收集蛋白A峰。

（3)取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反應(yīng)6h，混合物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以上兩種PE標記制品，可最后溶于0.01mol/l pH7.4PB(含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3),0～5℃保存。

（六)藍色熒光素標記抗體方法

Kbaffan等（1986)首先創(chuàng)立了藍色熒光素標記和染色技術(shù)，可進行雙標記或多標記。

（1)取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC)260μg溶于二甲亞砜25μl中。

（2)將上液加入10ml IgG的巴比妥緩沖液（0.5mol/L,pH8.5,內(nèi)含50～100mg IgG)中，室溫反應(yīng)2h，過Sephadex G-50除去游離熒光素。

AMC呈黃色結(jié)晶固體，最大吸收波長354nm,最大熒光波長430nm。

三、熒光抗體質(zhì)量控制

對制備的熒光抗體必須進行質(zhì)量鑒定，主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。

（一)染色特異性和敏感性的測定

1．特異性染色效價的測定直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應(yīng)抗原標本作一系列染色，熒光強度在“+++”的最大釋釋度，即為該熒光抗體的染色滴度（效價)或單位。實際染色應(yīng)用時，可取低一個或兩個稀釋度（即2～4個單位)，如染色效價為1：64，實際應(yīng)用時可取1：32或1：16。間接染色效價可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強度“++”為標準，染色用效價和直接法相同。

2．非特異性染色測定根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。

3．吸收試驗在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用以染相應(yīng)抗原陽性標本，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。

4．抑制試驗如前述。

（二)F/P比值的測定

F（熒光素)和P（抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為1～2。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，降低敏感性。

1．蛋白質(zhì)定量測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。

2．結(jié)合熒光素定量　先制作熒光素定量標準曲線，即準確稱取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量為10 μg/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光亮度計在490nm波長測定光密度值（OD)，以光密度為縱坐標，熒光素含量為橫坐標，作標準函數(shù)圖。

熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm,FITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93～495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。

F/P比值的計算：可按以下公式計算。

式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。

測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：

按圖3-4測定法更為簡便，即先用276nm波長測得蛋白質(zhì)的OD值，再用493波長測得FITC的OD值，將這兩個OD值在圖3-14上連成一直線，直線與各縱線交叉處，即可查出標記抗體的以下數(shù)值：FITc μg/ml ，F(xiàn)/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。