本品系采用布bhskgw.cn/yaoshi/氏菌弱毒菌株，經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防布氏菌病。
1 菌種
1.1 用弱毒牛型104M菌種。菌種應(yīng)由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。
1.2 菌種應(yīng)經(jīng)凍干，保存于2～8℃，并指定專人負(fù)責(zé)保管。
1.3 禁止使用通過動(dòng)物后再分離培育出之菌株制造菌苗。
1.4 菌種的免疫力試驗(yàn)每3年至少檢定一次。
1.5 菌種檢定
1.5.1 培養(yǎng)特性
在含有1∶50000堿性復(fù)紅培養(yǎng)基上應(yīng)生長，但在含有同樣濃度的硫堇培養(yǎng)基上不應(yīng)生長（亦可用紙片法檢查)，在肝瓊脂斜面培養(yǎng)基上產(chǎn)生微量硫化氫。涂片鏡檢應(yīng)為革蘭氏陰性球桿菌。
1.5.2 變異檢查
用生理鹽水將新鮮培養(yǎng)物制成含菌數(shù)為25億～30億/ml的菌懸液，置90℃水浴中30分鐘，不應(yīng)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。用同樣濃度的菌懸液，與1∶1000三勝黃素水溶液等量混合，于37℃放24小時(shí)，不應(yīng)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。用結(jié)晶紫菌落染色法檢查，菌落變異率不得超過3%。
1.5.3 噬菌體裂解試驗(yàn)
將菌種接種于肝瓊脂平皿上，滴加布氏菌Tb噬菌體1滴，于37℃培育44～48小時(shí)，在噬菌體流過的地方應(yīng)無本菌生長。
1.5.4 血清學(xué)試驗(yàn)
用生理鹽水將新鮮培養(yǎng)物制成含菌數(shù)為50億/ml的菌懸液，與已知效價(jià)的布氏菌診斷血清作凝集反應(yīng)，其凝集價(jià)應(yīng)達(dá)到血清原效價(jià)。
1.5.5 殘余毒力檢查
用生理鹽水將37℃培育44～48小時(shí)之肝瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物制成菌懸液，并稀釋成15億/ml、30億/ml、60億/ml、120億/ml和240億/ml等5個(gè)濃度的菌懸液。取體重18～20g小白鼠25只分為5組，各組分別用不同濃度的菌懸液腹腔注射，每只0.5ml，觀察7天，計(jì)算LD50，其值應(yīng)為10～20億菌。
1.5.6 免疫力試驗(yàn)
用生理鹽水將菌種1代新鮮培養(yǎng)物制成濃度為2億/ml的菌懸液。取體重300～350g豚鼠10只。每只皮下注射1ml，經(jīng)25～30天后，每只豚鼠皮下攻擊羊型強(qiáng)毒布氏菌10個(gè)或20個(gè)感染量（MID)。同時(shí)取3組健康豚鼠作對(duì)照，每組3只，分別于各組豚鼠皮下注射0.5、1及2個(gè)MID。免疫及對(duì)照豚鼠于注射毒菌懸液后均觀察25～30天后解剖，取出鼠蹊部淋巴結(jié)、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)、肝及脾分別接種肝瓊脂中管斜面培養(yǎng)基，于37℃培育10天。如免疫動(dòng)物組織之培養(yǎng)物有布氏菌生長，應(yīng)用硫堇染科培養(yǎng)基（亦可用紙片法)和硫化氫反應(yīng)做菌型鑒別試驗(yàn)。注射1個(gè)MID的3只對(duì)照豚鼠都必須發(fā)生全身感染，即肝臟或脾臟應(yīng)分離出羊型毒菌。免疫組攻擊10個(gè)MID時(shí)， 10只豚鼠中不應(yīng)有2只以上分離出羊型毒菌；攻擊20個(gè)MID時(shí)，10只豚鼠中不應(yīng)有3只以上分離出羊型毒菌。
2 菌苗制造
2.1 制造菌苗的工作室應(yīng)專用，不得與其他細(xì)菌工作混用。生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，非制造菌苗用的其他布氏菌不得帶到生產(chǎn)工作室內(nèi)。
2.2 制造菌苗可用pH6.6～7.2的肝浸液瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基。
2.3 啟開凍干菌種，接種在肝瓊脂斜面或其他適宜的培養(yǎng)基上，放37℃培育44～48小時(shí)為第1代。第1代菌須進(jìn)行1∶500三勝黃素玻片凝集試驗(yàn)，只有光滑型菌方可用于制造菌苗。第1代菌種斜面于2～8℃可保存15日。
2.4 將第1代菌種接種到肝瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放37℃培育44～48小時(shí)為第2代菌種。經(jīng)肉眼純菌檢查合格后，棄去凝固水，用無菌生理鹽水制成菌懸液。
2.5 將第2代菌種www.med126.com接種到瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，放37℃培育44～48小時(shí)，肉眼逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。
2.6 用含有蔗糖、明膠、硫脲和味精組成的保護(hù)液或其他適宜的保護(hù)液洗下菌苔或刮取菌苔，放入保護(hù)液內(nèi)。每數(shù)瓶培養(yǎng)物可采入或刮入1瓶（或1大管)保護(hù)液內(nèi)，此為菌苗原液，置2～8℃保存。每瓶（或大管)原液均按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行純菌試驗(yàn)。
2.7 將純菌試驗(yàn)合格的原液合并，如每安瓿凍干菌苗為10人份，裝量0.5ml原液，則應(yīng)合并后的原液稀釋成每ml含菌1800億～2000億，使每1人份菌苗含90億～100億。由原液采集到冷凍干燥之間隔不得超過7天。稀釋后的原液經(jīng)純菌試驗(yàn)合格后即可分裝安瓿凍干。
2.8 同一日采集的原液同一次凍干者為1批。如1批有數(shù)瓶，應(yīng)分為亞批。
3 冷凍干燥
菌苗原液分裝安瓿完畢后應(yīng)立即在-30℃以下進(jìn)行冷凍。干燥時(shí)間可根據(jù)水分含量及活菌數(shù)來決定。干燥完畢后進(jìn)行真空封口。亦可用充氮封口。
4 成品檢定
4.1 物理化學(xué)檢查
凍干菌苗應(yīng)為乳白色疏松體，加入生理鹽水后，應(yīng)于1分鐘內(nèi)溶解成均勻懸液。用真空測(cè)定器檢查安瓿應(yīng)為真空。水分含量不得超過3%。
4.2 菌型檢查
每亞批菌苗應(yīng)用硫堇培養(yǎng)基或紙片法及硫化氫反應(yīng)做菌型鑒別檢查，應(yīng)呈牛型布氏菌的培養(yǎng)特性。
4.3 純菌試驗(yàn)
每亞批菌苗抽樣按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
4.4 活菌計(jì)數(shù)及菌落變異檢查
每亞批取3支安瓿，加生理鹽水溶解混勻后比濁。將菌液濃度稀釋為含菌10億/ml，再用生理鹽水做10倍系列稀釋至10-6，取10-6或其他適宜的稀釋度之菌液接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種0.1ml。用涂菌棒涂勻后放37℃培育4～5天，計(jì)算活菌數(shù)。凍干后活菌率不得少于50%，如不合格可復(fù)試，經(jīng)復(fù)試仍低于50%者則該批菌苗廢棄。同時(shí)用結(jié)晶此菌落染色法檢查，菌落變異率不得超過10%。
4.5 濃度測(cè)定
菌苗經(jīng)溶解后，按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定濃度，每人份含菌數(shù)應(yīng)為90億～100億。
4.6 安全試驗(yàn)
每亞批取3支安瓿，用生理鹽水溶解后混勻。用體重18～20g小白鼠5只，每只皮下注射10億菌/ml的菌懸液0.5ml。觀察7日不應(yīng)有死亡，如有死亡應(yīng)復(fù)試一次，仍有死亡，則該批菌苗廢棄。
4.7 免疫力試驗(yàn)
10批以下者至少抽1批進(jìn)行免疫力試驗(yàn)，10批以上者，每10批抽1批。用滅菌生理鹽水溶解凍干菌苗，并稀釋成5億菌/ml菌懸液。取體重300～350g豚鼠10只，每只皮下注射1ml。經(jīng)25～30日后，每只豚鼠皮下攻擊羊型線毒布氏菌10個(gè)或20個(gè)MID。同時(shí)用3組健康豚鼠作對(duì)照，每組3只，各組豚鼠分別于皮下注射0.5、1和2MID。各組不能自拔于注射毒菌懸液后25～30日解剖，取鼠蹊部淋巴結(jié)、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)、肝及脾，分別接種肝瓊脂中管斜面培養(yǎng)基，于37℃培育10天。如免疫動(dòng)物組織之培養(yǎng)物有布氏菌生長，需用硫堇培養(yǎng)基（亦可用紙片法)和硫化氫反應(yīng)做菌型鑒別試驗(yàn)。注射1個(gè)MID的3只對(duì)照豚鼠都必須發(fā)生全身感染，即肝臟或脾臟應(yīng)分離出羊型毒菌。攻擊10個(gè)MID時(shí)，10只免疫豚鼠中不應(yīng)有3只以上分離出羊型毒菌；攻擊20個(gè)MID時(shí)10只免疫豚鼠中不應(yīng)有4只以上分離出羊型毒菌。
5 保存與效期
應(yīng)保存于2～8℃暗處。自凍干后活菌數(shù)檢定合格之日起效期為1年。
