中國幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌的臨床與實(shí)驗(yàn)研究

從Warren和Marshall在1983年報(bào)道從慢性活動性胃炎病人胃粘膜中成功地培養(yǎng)出螺旋形細(xì)菌以來，來自澳大利亞、英國、荷蘭及我國不少研究結(jié)果均表明，該菌與慢性胃淡及消化性潰瘍有密切關(guān)系，該菌為幽門螺桿菌（Helicobacterwww.med126.com pylorides，簡稱Hp)。為了進(jìn)一步研究Hp的致病性、分布及來源，我們對1000例內(nèi)鏡檢查患者進(jìn)行Hp微生物學(xué)及組織病理學(xué)檢查，并對5只成年狗、10只分健康小白鼠及10只大白鼠進(jìn)行有關(guān)Hp的實(shí)驗(yàn)研究，旨在評估人與其它動物胃粘膜中Hp陽性率、臨率意義及與慢性胃病的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1　臨床研究

本研究對象為有化道癥狀進(jìn)行內(nèi)鏡檢查的1027例住院及門診患者，經(jīng)篩選后對1000例資料完整病例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其中，男709例，女291例，年齡12歲～82歲，平均47.2歲，內(nèi)鏡或病理最后診斷為慢性淺表性胃炎518例，慢性萎縮性胃炎174例，胃潰瘍56例、胃癌47例，胃息肉12例，十二指腸潰瘍121例，十二指腸炎38例，食管炎28例，食管癌6例。病人禁食12h，清晨空腹按常規(guī)準(zhǔn)備后進(jìn)行內(nèi)鏡檢查，內(nèi)鏡用洗必泰和乙醇消毒，活檢鉗用同樣方法處理，每個(gè)病人除在病變部位活檢外，均在胃竇距幽門2cm范圍內(nèi)取2～3個(gè)活檢標(biāo)本，分為兩份，一份作細(xì)菌培養(yǎng)和雙相快速診斷，另一份作組織病理學(xué)檢查。

組織學(xué)檢查　活檢標(biāo)本在10％甲醛溶液中固定，然后按常規(guī)步驟制做病理切片。所有活檢病理切片均做蘇木－伊紅（HE)染色，126例同時(shí)做Warthin－Starth染色，部分病例還做了革蘭染色及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)Hp者為陽性，否則為陰性。

微生物學(xué)檢查　取新鮮標(biāo)本一塊，先在Hp選擇性血脂平板涂抹，然后將該標(biāo)本插入尿素酶快速診斷培養(yǎng)皿中，觀察其反應(yīng)，陽性者一般3min～15min即可在組織塊周圍出現(xiàn)紅色反應(yīng)環(huán)、反應(yīng)環(huán)出現(xiàn)的快慢與大小和組織塊內(nèi)含菌量的多少成正比。尿素酶試驗(yàn)后，將原組織塊取出放在作氧化酶測試的濾紙片上，3min～15min內(nèi)組織粘膜部分變黑色者為陽性，表示有Hp存在，否則為陰性。組織塊變黑的快慢也與Hp量成正比。我們稱之為“雙快試驗(yàn)”，Hp對雙快試驗(yàn)均成陽性反應(yīng)（雙相陽性)，有變形污染者尿素酶試驗(yàn)可呈陽性，而氧化酶試驗(yàn)陰性，假單胞菌屬污染則尿素酶試驗(yàn)陰性，而氧化酶試驗(yàn)陽性，反以“雙快試驗(yàn)”對Hp感染診斷有極重要的鑒別意義。用作細(xì)菌培養(yǎng)的平板置37℃微嗜氧環(huán)境或CO₂環(huán)境中培養(yǎng)3d～4d。細(xì)菌生長后，對菌落特征、生化反應(yīng)、形態(tài)學(xué)研究及多種抗生素、中藥的藥敏試驗(yàn)等項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行觀察。

1.2　動物實(shí)驗(yàn)

取5只成年健康狗，用硫苯妥鈉靜脈麻醉后進(jìn)行纖維內(nèi)鏡觀察，并從胃竇小彎距離門2cm取活檢兩塊、胃體小彎活檢兩塊、分別進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查及病理組織學(xué)檢查�；顧z之后，由活檢孔道插塑料導(dǎo)管，向胃注入事先制作的新鮮純Hp活菌液5ml（含菌數(shù)約為10⁸/ml)結(jié)束檢查之后動物隔離飼養(yǎng)，于第二周再灌5ml，第3，4，5，6，7，8周各作內(nèi)鏡檢查一次并活檢，標(biāo)本處理同前。取健康大白鼠10只，其中兩只處死后取其全胃，于胃竇體各剪兩塊標(biāo)本分別進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查及病理組織學(xué)檢查。其它大白鼠均用胃管向胃內(nèi)注入純Hp菌液1ml（含菌數(shù)同上)、第2周再灌1ml，于第3，4，5，7周各處死兩只，取出胃標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)及病理組織學(xué)檢查，方法同前。取健康小白鼠10只，用與大白鼠同樣的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1　臨床研究

1000例各胃十二指腸疾病中微生物學(xué)不同方法的Hp檢出率見表1。以十二指腸球部潰瘍、十二指腸球炎及胃潰瘍的檢出率最高。快速診斷陽性而培養(yǎng)陰性者18例，快速診斷陰性而培養(yǎng)陽性者25例。一例尿素酶試驗(yàn)陽性而氧化酶鑒測為陰性，經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定為大量變形菌污染。126例病理組織學(xué)切片用不同染色方法的Hp檢出率見表2，其中細(xì)菌學(xué)陽性、切片陰性者12例，細(xì)菌學(xué)陰性切片陽性者3例。有16例胃潰瘍患者的胃標(biāo)本同時(shí)取自胃竇距幽門2cm以內(nèi)胃粘膜及胃潰瘍組織，取自胃竇粘膜的標(biāo)本中有10例Hp微生物學(xué)檢查為陰性，取自潰瘍組織的標(biāo)本及2例陽性。10例胃癌患者胃竇粘膜標(biāo)本中有6例Hp陽性，取自癌組織的標(biāo)本無一例陽性，這表明Hp不易在潰瘍及癌組織中存在。

表1　胃十二指腸疾患1000例Hp微生物學(xué)檢出率

表2　胃活檢標(biāo)本126例切片Hp陽性結(jié)果比較

Hp為革蘭陰性桿菌，菌體常呈現(xiàn)彎曲狀、或呈S形，短螺旋形及海鷗展翼形。主要位于胃粘膜的胃粘液層下，常集居成團(tuán)，電鏡下觀察菌體表面帶有光滑外衣，菌體一端長有3～6根鞭毛，鞭毛末端有的呈球狀。Hp為兼性厭氧菌，但屬于微需氧范圍。在無氧條件下不生長，氧含量超過5％時(shí)則發(fā)育不良甚至不能生長，該菌在27℃以下及42℃以上均不能生長，最適宜溫度為37℃，并要求培養(yǎng)罐中保持較高濕度（相對濕度98％)。Hp在培養(yǎng)基上形成的菌落由于培養(yǎng)基營養(yǎng)價(jià)值不同而大小各異。在哥倫比亞瓊脂上菌落較大，可達(dá)2mm左右，在其它培養(yǎng)基上均為1mm左右的小菌落，菌落為圓形，略平、光滑或稍暗淡、無色、半透明狀、無粘性、有時(shí)可見有狹窄的模糊不清的溶血環(huán)，無特殊氣味。本菌生化反應(yīng)主要表現(xiàn)為尿素酶陽性、過氧化氫酶陽性，氧化酶陽性、磷酸酶陽性。不利用糖類、不分解馬尿酸、靛基質(zhì)和硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性。

Hp對多種抗生素均顯示高度敏感染，其最小抑菌度為：氨芐青霉素0.5ml/L，amoxycillin0.25ml/L，紅霉素0.25ml/L，青霉素1mg/L，四環(huán)素10g/L，慶大霉素10g/L，metronidzole5g/L，rimcthoprin2.5g/L，萘啶酸30g/L，但本菌對多粘菌素B、二性霉素、吡呱酸、萬古霉素等耐藥。對某些中藥如黃柏、黃蓮、黃芩等亦顯示敏感。

2.1　動物實(shí)驗(yàn)

5只健康成年狗實(shí)驗(yàn)前內(nèi)鏡及活檢病理組織學(xué)檢查，胃粘膜基本正常，Hp尿素酶快速診斷培養(yǎng)及切片染色均為陰性。接種Hp1周后有3只狗內(nèi)鏡及活檢胃粘膜有淺表胃炎癥改變，切片W－S染色發(fā)現(xiàn)少數(shù)Hp、尿素酶及Hp培養(yǎng)亦為陽性反應(yīng)，其中兩只持續(xù)3周，一只3周以后胃粘膜炎癥消失，Hp轉(zhuǎn)陰。另兩例灌注菌液前后內(nèi)鏡檢查胃粘膜正常，Hp試驗(yàn)陰性。

10只大白鼠及10只小白鼠前后各階段檢查胃粘膜均基本正常，Hp檢查陰性。

3　討論

本文材料顯示蘭州地區(qū)人群胃粘膜中Hp的檢出率很高，與粘膜的病理組織學(xué)炎癥和消化性潰瘍密切相關(guān)，這些結(jié)果與國內(nèi)外一些報(bào)道基本一致，尿素酶試驗(yàn)培養(yǎng)及組織學(xué)切片檢查對Hp檢出率幾乎同樣敏感。一般認(rèn)為使用特殊的W－S染色是檢查Hp的較好方法，細(xì)菌是紫色，很容易辨認(rèn)，但操作煩瑣費(fèi)時(shí)。我們用HE染色達(dá)到了與前者幾乎同樣的效果，部分病人用革蘭染色也能清楚顯示Hp存在。對Hp的識別主要利用其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特片及特殊的生長環(huán)境。其生化反應(yīng)主要表現(xiàn)在尿素酶及氧化酶雙相陽性，但變形菌也可產(chǎn)生尿素酶，可呈尿素酶陽性反應(yīng)，而氧化酶陰性。我們采用“雙快試驗(yàn)”對于鑒別Hp與變形菌的污染，提供了一項(xiàng)新方法。

為了回答Hp究竟是胃部疾患的病原菌還是共生功生菌、機(jī)會菌的問題，近年來國內(nèi)外臨床工作者、病理學(xué)家和微生物學(xué)家密切配合進(jìn)行了大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，胃內(nèi)Hp的存在與胃粘膜炎癥程度呈正相關(guān)，而相對正常胃粘膜、胃癌、萎縮性胃炎及腸化病人胃標(biāo)本中Hp檢出率很低。我們的動物實(shí)驗(yàn)表明，5只成年狗實(shí)驗(yàn)前胃粘膜正常，Hp陰性。在灌注Hp菌液1周后，有3只胃粘膜發(fā)生炎癥改變，Hp檢查陽性。其中兩只持續(xù)3周、一只持續(xù)4周以后，胃粘膜相繼恢復(fù)正常，Hp亦轉(zhuǎn)為陰性，說明Hp對胃炎致病因素可能有關(guān)。10只大白鼠、10只小白鼠灌注菌液前后胃粘膜無明顯改變，Hp檢驗(yàn)陰性。是否Hp對嚙齒類動物無致病性，值得進(jìn)一步研究。

病理組織學(xué)染色觀察，Hp主要位于胃竇粘膜的粘液層下，常聚集成團(tuán)，在胃體食管及十二指腸粘膜中有時(shí)也發(fā)現(xiàn)少數(shù)Hp存在，但檢出率遠(yuǎn)低于胃竇粘膜。觀察結(jié)果還表明，在同一病例中胃竇粘膜Hp檢查陽性，而潰瘍及癌組織中Hp常為陰性，說明Hp不易在潰瘍及組織存在。