�。�3)背景染色低：在酶標(biāo)抗體法中，被標(biāo)記的非特異性抗體可與組織成分結(jié)合，造成背景染色（圖4-6)。從理論上講，在非標(biāo)記抗體法，連結(jié)抗體中，即使存著非特異性抗體，因其不是抗第一抗體種屬I(mǎi)gG的特異性抗體，故亦不能與抗HRP抗體結(jié)合，不能把PAP復(fù)合物連結(jié)在此非特異性抗體上（圖4-7)。當(dāng)然，PAP復(fù)合物內(nèi)也可能存在些非抗HRP的抗體，假如這部分抗體能夠與橋抗體及組織成分結(jié)合，但因其不是抗HRP的抗體，故不能與HRP結(jié)合，無(wú)酶活性。因此說(shuō)橋抗體的引入，使ICC的特異性得到了雙重放大，S/N增大。但也有人認(rèn)為，過(guò)量的橋抗體及PAP復(fù)合物等均易與Fc受體結(jié)合，致使背景染色增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明：合適的切片準(zhǔn)備、恰當(dāng)?shù)貞?yīng)用封閉性阻斷劑、正常血清以阻斷非特異性結(jié)合，加之適當(dāng)?shù)剡x擇抗體稀釋度和抑制內(nèi)源性酶活性，PAP法和間接法二者的背景均相當(dāng)?shù)汀?/P>
圖4-6 間接酶標(biāo)抗體法
背景染色增高原因
圖4-7 PAP法降低背景的原理
（4)假陰性及其處理：應(yīng)用PAP法顯示抗原含理較多的組織或冰凍切片組織抗原保持良好的標(biāo)本時(shí)，可導(dǎo)致陰性結(jié)果，這種現(xiàn)象稱(chēng)為假陰性。Vandesand發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用PAP法顯示大鼠視上核和室旁核內(nèi)加壓素神經(jīng)細(xì)胞分布時(shí)，第一抗體（1：200)染色，加壓素含有細(xì)胞呈強(qiáng)性。如果取材前24～48h，腦室內(nèi)注射秋水仙素，阻斷軸突運(yùn)輸以增加視上核和視旁核加壓素含量，同時(shí)組織標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、再水化等處理以增加抗體的通透性，同樣稀釋度染色，結(jié)果卻陰性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：增加抗體的稀釋度，開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性染色，稀釋至1：1500時(shí)，染色最強(qiáng)，繼續(xù)增加抗體稀釋度，染色強(qiáng)度則下降。Bigbee（1977)認(rèn)為假陰性是第一抗體用量過(guò)高與組織抗原結(jié)合過(guò)多，使相鄰兩個(gè)伉體的Fc段間的距離（d)恰好是連結(jié)抗體的兩個(gè)Fab段與之結(jié)合的長(zhǎng)度，于是連結(jié)抗體不存在游離Fab段，僅剩無(wú)活性的Fc段，所以不能將PAP復(fù)合物連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上，結(jié)果陰性（圖4-8)。因此，借助PAP法研究組織抗原分布，特別是新鮮組織冰凍切片組織抗原保存較好時(shí)，第一抗體盡量用高稀釋度，避免假陰性。石蠟切片很少發(fā)生這種現(xiàn)象，所以PAP法在石蠟切片的ICC觀察中更為常用。
圖4-8 示假陰性：組織切片上結(jié)合過(guò)多的第一抗體，兩抗體間的距離d 恰好適于橋抗體的兩個(gè)Fab段與之結(jié)合，無(wú)PAP復(fù)合物結(jié)合的位置
�。�5)橋抗體：也稱(chēng)連結(jié)抗體，它的兩個(gè)Fab段具有相同的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及與抗原結(jié)合的能力。因此，當(dāng)?shù)谝豢贵w和PAP復(fù)合物中抗HRP抗體來(lái)自同一種屬動(dòng)物時(shí)，橋抗體能同時(shí)與上述兩種抗體結(jié)合，起到橋的作用。為了確保橋抗體的兩個(gè)Fab段之一與第一抗體結(jié)合、另一個(gè)與抗HRP抗體結(jié)合，橋抗體需用高濃度。另外，在非標(biāo)記抗體酶法中可用葡萄球菌蛋白A（SPA)代替橋抗體，進(jìn)行ICC染色。SPA不受種屬限制，應(yīng)用范圍廣。
�。�6)PAP復(fù)合物：在PAP法及酶橋法中，特別強(qiáng)調(diào)第一抗體和抗HRP抗體必須來(lái)自同一種屬，橋抗體才能發(fā)揮橋的作用，將其連結(jié)在一起；但一些研究表明：第一抗體和抗HRP抗體來(lái)自不同種屬，連結(jié)抗體仍可作為橋，將二者連在一起。例如Erlandsen發(fā)現(xiàn)豚鼠IgG作為第一抗體，可用羊抗兔IgG、兔PAP復(fù)合物顯示之一。Grzanna（1982)根據(jù)這一報(bào)告，利用豚鼠抗DBH血清作第一抗體，羊抗兔IgG為橋抗體，12例兔血清制得的PAP復(fù)合物中，僅3例染色較佳。這種第一抗體和PAP復(fù)合物來(lái)自不同種屬獲得的陽(yáng)性結(jié)果主要依賴于種屬間的交叉反應(yīng)。多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明：抗體和種屬交叉反應(yīng)是有限的，也是不完全的。故利用橋抗體進(jìn)行ICC染色時(shí)，仍以第一抗體和抗酶抗體來(lái)自同一種屬為宜。
